Выделение фекальной (микро) РНК

Резюме

Этот протокол изолирует высококачественную общую РНК из образцов фекалий животных и людей. Коммерческий набор для изоляции миРНК используется со значительной адаптацией для выделения чистой РНК с оптимизированным количеством и качеством. Изоляты РНК хороши для большинства последующих анализов РНК, таких как секвенирование, микромассив и ОТ-ПЦР.

Аннотация

Становится ясно, что РНК существует в просвете кишечника и фекалиях у животных и человека. Протокол, описанный ниже, изолирует общую РНК, включая микроРНК, из фекальных образцов животных и людей. Цель состоит в том, чтобы изолировать общую РНК с высокой чистотой и количеством для последующих анализов, таких как секвенирование РНК, ОТ-ПЦР и микромассив. Преимуществами этого оптимизированного протокола при выделении миРНК являются возможности выделения высокоочищенных РНК-продуктов с описанными дополнительными этапами промывки, увеличенное количество РНК, полученной улучшенным методом при повторном суспензии образца, и важные советы по обеззараживанию. Одним из ограничений является невозможность обработки и очистки более крупной выборки более 200 мг, поскольку эти размеры выборки вызовут трудности в четком формировании интерфазы. Следовательно, большой размер выборки может загрязнить водную фазу, подлежащую извлечению, как описано в протоколе, органическими веществами, которые влияют на качество РНК, выделенной в конце. Тем не менее, изоляты РНК из образца до 200 мг достаточны для большинства последующих анализов.

Введение

Внеклеточная РНК признается значимым фактором, опосредующим многие биологические процессы¹. Внеклеточная РНК в кале была впервые зарегистрирована в 2008 году как маркер рака толстой кишки и активного язвенного колита², и недавно она была выявлена как нормальный компонент просвета кишечника и кала и опосредует связь хозяина с микробом ^3,4,5. Целью этого протокола выделения РНК является извлечение высококачественной внеклеточной РНК из образцов фекалий, собранных у животных и людей. Протокол был адаптирован из коммерческого комплекта для изоляции миРНК. Полученная РНК используется для последующего анализа, такого как секвенирование РНК, ОТ-ПЦР и микромассив. Протокол включает в себя несколько важных и полезных советов по максимизации количества и качества РНК, обнаруженных в фекалиях животных и людей. Причиной разработки и оптимизации этого метода выделения РНК (в том числе микроРНК) является снижение микробной РНК в кале, ограничение переменных в научных исследованиях и анализ состава РНК в кишечнике без учета различных смешанных факторов и источников загрязнения. Следует отметить, что эта изоляция РНК минимизирует высвобождение РНК из живых клеток и живых микробов (клеточная РНК). Он фокусируется на внеклеточных РНК, которые были высвобождены клетками кишечника или приобретены при приеме пищи. В принципе, этот метод не подходит для исследований, где исследуется микробный транскриптом.

протокол

Все методы с участием исследуемых животных, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Бригама и Женской больницы Гарвардской медицинской школы.

Все методы, связанные с человеческими исследованиями, описанные здесь, соответствуют руководящим принципам, установленным Комитетом по исследованиям человека Партнеров.

1. Сбор образцов фекалий

1. Автоклав или подготовьте стерильную и не содержащую нуклеазы микроцентрифужную трубку объемом 2 мл с винтовой крышкой для каждого животного субъекта в эксперименте.
   1. Для людей предоставьте соответствующее, не содержащее нуклеаз и стерильное устройство для сбора образцов стула для каждого субъекта.
2. Соберите 25-100 мг (примерно 1-4 фекальные гранулы для образцов фекалий мышей) образцов фекалий от каждого животного субъекта в стерильной среде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Две или более фекальные гранулы (~50 мг или тяжелее) являются предпочтительными для получения РНК высочайшей чистоты.
   1. Используйте все необходимые средства индивидуальной защиты (СИЗ) и материалы, например: пару лабораторных перчаток, дезинфицирующий спрей и стерильное бумажное полотенце, чтобы стерилизовать рабочую зону, где размещен предмет исследования животных, чтобы избежать загрязнения образцов фекалий.
      1. Для людей проинструктируйте каждого субъекта исследования / коллекционера собрать 100-200 мг образцов стула в максимально стерильной среде. Используйте стандартную стерильную операцию и избегайте загрязнения образца стула.
3. Соберите образцы фекалий от каждого животного непосредственно в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл с винтовой крышкой, не касаясь каких-либо других поверхностей, чтобы избежать загрязнения.
   1. Для людей проинструктируйте каждого субъекта испражняться непосредственно в соответствующее устройство для сбора (например, набор для сбора стерильных образцов стула), чтобы избежать загрязнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проинструктируйте субъекта избегать загрязнения поверхностями туалета, водой, мочой или любыми другими нестерильными поверхностями / предметами.
4. Заморозьте образцы фекалий, собранные в микроцентрифужных пробирках 2 мл, непосредственно при -80 °C или поместите в ведро сухого льда для лучшего количества и качества РНК перед повторной суспензией кала, как описано в шагах ниже.
   1. Для образцов стула человека аликвотируйте каждый свежий образец по 200 мг в микроцентрифужные трубки объемом 2 мл с винтовыми колпачками и замораживайте их при -80 °C перед повторной суспензией кала, как описано ниже.
      1. Для хранения образцов стула не в микроцентрифужных трубках по 2 мл с винтовыми колпачками взвешивают и переносят по 100-200 мг каждого из замороженных образцов в отдельные микроцентрифужные трубки по 2 мл с винтовыми колпачками перед повторной суспензией кала, как описано ниже.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов стула человека избегайте приема более 200 мг образцов стула для выделения РНК, так как это может вызвать трудности на следующих этапах. При перегруженном образце в микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл водная фаза, органическая фаза и интерфаза не могут быть четко сформированы и разделены. Здесь процедура может быть приостановлена.

2. Приготовления моющих растворов

1. Добавьте 21 мл 100% этанола американского химического общества (ACS) в моющий раствор 1, поставляемый в комплекте для изоляции миРНК (см. Таблицу материалов), чтобы достичь окончательного объема 30 мл, как показано на флаконе. Вихрь до тех пор, пока все не растворится в бутылке.
2. Добавьте 40 мл 100% этанола класса ACS в раствор для мытья 2/3, предоставленный для достижения конечного объема 50 мл, как показано на флаконе. Вихрь в течение 5 с или до тех пор, пока конечная смесь не будет хорошо перемешана.

3. Подготовка оборудования и материалов

1. Распылите рабочую зону и оборудование, например: лабораторный стенд, рабочую зону в химическом вытяжном шкафу и стойки микроцентрифугных труб, раствором для обеззараживания рибонуклеазы (РНКазы) (например, коммерчески доступным раствором для обеззараживания РНКазы). Чтобы избежать загрязнения, наносите раствор для обеззараживания РНКазы на поверхности, где и когда это будет сочтено необходимым.
2. Наденьте чистое лабораторное пальто, наденьте маску для лица и наденьте соответствующие лабораторные перчатки, чтобы защитить РНК в образцах фекалий от нуклеаз, присутствующих на коже человека. Распыляйте перчатки раствором для обеззараживания РНКазы и часто меняйте перчатки, чтобы избежать загрязнения.
3. Подготовьте ведро сухого льда для образцов фекалий, хранящихся при -80 °C, чтобы предотвратить оттаивание перед повторной суспензией фекалий, и ведро льда для материалов, например: Кислота-Фенол: Хлороформ, для продления срока хранения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что материалы, включая среды, используемые в протоколе, являются стерильными без загрязнения нуклеазами.

4. Повторное суспендирование кала

1. Повторное суспендирование 25-100 мг образцов фекалий в 600 мкл стерильного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (DPBS).
   ВНИМАНИЕ: Образцы фекалий должны быть обработаны немедленно при размораживании от -80 ° C даже без частичного оттаивания, чтобы свести к минимуму высвобождение РНК и клеточной РНК, поскольку кристаллы льда разрывают как внутренние, так и внешние клеточные компартменты, когда клетки в образце оттаивают.
   1. Добавьте 600 мкл 1x DPBS в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл с винтовой крышкой, содержащей образцы фекалий при комнатной температуре (RT).
   2. Инкубируйте смесь образцов фекалий, погруженных в 600 мкл 1x DPBS в 2 мл микроцентрифужной трубки, закрытой в течение 30 мин при RT.
   3. Повторно суспендировать смесь путем затирания наконечником пипетки объемом 1 мл и вихревым колодцем с закрытой микроцентрифужной трубкой объемом 2 мл. Для оптимизации и увеличения количества и качества РНК повторно суспендируют смесь гомогенизатором с установкой на один цикл при S4000 (или 4000 об/мин) и 45 с.

5. Органическая экстракция

ВНИМАНИЕ: Используйте опасную химическую вытяжку для следующих этапов до Этапа 6 с использованием кислоты-фенола: хлороформ и 100% этанол класса ACS из-за их токсичности и воспламеняемости. Меняйте СИЗ по мере необходимости и соблюдайте надлежащие стандартные меры предосторожности при работе с опасными материалами.

1. Экстракт РНК с 600 мкл кислоты-фенола: хлороформ (объем кислоты-фенола: требуемого хлороформа равен исходному объему добавленного 1x DPBS на стадии 4.1).
   1. Добавьте 600 мкл кислоты-фенола: хлороформа в суспензию из стадии 4.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выводите кислоту-фенол: хлороформ из нижней фазы в бутылке, когда верхнюю фазу смешивают с водным буфером. Если интерфаза между этими двумя фазами нарушена, то подождите и выведите кислоту-фенол: хлороформ только тогда, когда интерфаза восстановится, чтобы избежать загрязнения.
2. Вращайте смесь в течение 60 с, чтобы тщательно перемешать. Альтернативно, чтобы оптимизировать и увеличить количество РНК в выходе, смешивают с помощью гомогенизатора с установкой на один цикл при S4000 и 45 с.
3. Центрифуга в течение 15 мин при 10 000 х г при РТ для разделения водной и органической фаз с помощью микроцентрифуги. После центрифугирования интерфаза должна быть компактной. Если нет, повторите центрифугирование.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если интерфаза не может быть такой компактной, как хотелось бы, возможно, из-за неравномерного отношения исходного объема к объему добавленного кислотно-фенольного: хлороформа после нескольких повторов центрифугирования, приступайте к восстановлению водной фазы с большей осторожностью, чтобы избежать загрязнения.
4. Восстановить водную фазу и перенести ее в новую микроцентрифужную трубку объемом 2 мл с шарнирным колпачком (не предусмотрено комплектом изоляции миРНК).
   1. Аккуратно удалите водную (или верхнюю) фазу, не нарушая нижнюю фазу, и перенесите ее в новую микроцентрифужную трубку объемом 2 мл с шарнирным колпачком. Обратите внимание на передаваемый объем (например, ~500 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда интерфаза компактна и верхняя фаза четко разделена, возможно, есть несколько крошечных остаточных частиц, плавающих в верхней части водной фазы. Пипетка осторожно избегает этих остатков и восстанавливает только видимо и четко отделенную водную фазу, чтобы обеспечить качественный выход РНК, даже если можно получить только небольшой объем водной фазы.

6. Окончательная изоляция РНК

1. Добавьте 1,25 объема 100% этанола сорта RT ACS в водную фазу в микроцентрифужной трубке объемом 2 мл (например, добавьте 625 мкл 100% этанола, если 500 мкл водной фазы извлечено из стадии 5.4.). Вихрь 3 с.
2. Загрузите смесь водной фазы и этанола через фильтрующий картридж, поставляемый в комплекте изоляции миРНК.
   1. Для каждого образца поместите картридж фильтра в одну из сборных пробирок, поставляемых в комплект.
      1. Пипетку и загрузите 600 мкл водно-фазно-этаноловой смеси в картридж фильтра.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Вихрь смеси ненадолго, чтобы тщательно перемешать этанол с водной фазой перед пипеткой. За один раз можно загрузить не более 700 мкл смеси водной фазы/этанола.
   2. Центрифуга при 10 000 х г в течение 90 с для фильтрации через смесь. Вращение с более высокой скоростью может повредить фильтр.
   3. Удалите фильтрат и повторяйте этапы 6.2.1-6.2.2 до тех пор, пока вся смесь не будет отфильтрована через одну и ту же фильтрующую мембрану при последовательных применениях. Сохраните и повторно используйте ту же коллекционную трубку для этапов стирки, приведенных ниже.
   4. Промыть фильтр 700 мкл раствора для промывки миРНК 1.
      ВНИМАНИЕ: Раствор для умывания миРНК 1 содержит гуанидин тиоцианат, который может вызвать раздражение кожи и серьезное повреждение глаз. Носите необходимые СИЗ, например: перчатки, лицевой щиток, защитное лабораторное пальто. Часто меняйте перчатки по мере необходимости.
      1. Нанесите 700 мкл промывочного раствора миРНК 1, рабочего раствора, приготовленного из 100% этанола класса ACS, в картридж фильтра.
      2. Центрифуга в течение 60 с для фильтрации раствора для промывки миРНК 1 через картридж фильтра.
      3. Выбросьте фильтрат из коллекторной трубки и поместите тот же фильтрующий картридж в ту же коллекторную трубку.
   5. Промывайте фильтр моющим раствором 2/3 один раз каждый с объемами 700 мкл, 500 мкл и 250 мкл последовательно.
      1. Нанесите 700 мкл промывочного раствора 2/3, рабочего раствора, приготовленного из 100% этанола класса ACS, в картридж фильтра.
         1. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин.
         2. Выбросьте фильтрат из коллекторной трубки и поместите тот же фильтрующий картридж в ту же коллекторную трубку.
      2. Нанесите 500 мкл моющего раствора 2/3 в картридж фильтра.
         1. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин.
         2. Выбросьте фильтрат из коллекторной трубки и поместите тот же фильтрующий картридж в ту же коллекторную трубку.
      3. Нанесите 250 мкл моющего раствора 2/3 в картридж фильтра.
         1. Центрифуга при 10 000 х г в течение 1 мин.
         2. Выбросьте фильтрат из коллекторной трубки.
      4. Переложите картридж фильтра в новую коллекторную трубку и вращайте узел в течение 5 минут, чтобы удалить остаточную жидкость из фильтра.

7. Элютная РНК с водой без нуклеазы 50 мкл

1. Перенесите картридж фильтра в новую коллекторную трубку. Пипетка 50 мкл безнуклеазной воды к центру фильтра и крышке коллекторной трубки.
   1. Инкубировать в RT в течение 10 мин.
   2. Вращайтесь в течение 5 мин при 8000 х г , чтобы восстановить РНК в новой коллекционной трубке.
   3. Определить концентрацию и чистоту восстановленной фекальной РНК с помощью флуорометра. Восстановленная фекальная РНК может храниться при -80 °C.

Результаты

Репрезентативные РНК были выделены из образцов фекалий мышей 50 мг (2 гранулы фекалий мыши) и 100 мг образцов стула человека соответственно и элюированы в воде без нуклеазы объемом 50 мкл. Спектрофотометрический анализ концентрации позволяет выделить общее количество 49 мкг и 16 мкг РНК соот...

Обсуждение

Важно использовать технику без РНКазы для предотвращения загрязнения РНКазы во время изоляции⁷. После центрифугирования и образования компактной интерфазы важно избегать межфазной, нижней фазы и загрязняющего вещества частиц, плавающего на вершине водной фазы при восст?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)	Thermo Fischer Scientific	AM9720
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fischer Scientific	14190-144
Gloves
Microcentrifuge
mirVana miRNA Isolation Kit	Thermo Fischer Scientific	AM1561
Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)
Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)	Thermo Fischer Scientific	AM9937
Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)
PowerLyzer 24 Homogenizer	QIAGEN	13155
RNaseZap RNase Decontamination Solution	Thermo Fischer Scientific	AM9780
Vortex Shaker