Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
在这里,我们提出了一种使用DNA程序化粘附的单细胞分辨率的微模式细胞方案。该协议使用台式光刻平台在载玻片上创建DNA寡核苷酸的图案,然后用市售的互补寡核苷酸标记细胞膜。寡核苷酸的杂交导致程序化的细胞粘附。
细胞的相对定位是组织细胞 - 细胞相互作用的微环境的关键特征。为了研究相同或不同类型的细胞之间的相互作用,微图案化技术已被证明是有用的。DNA程序化细胞组装(DPAC)是一种微图案化技术,使用DNA杂交将细胞粘附到底物或其他细胞上。DPAC中最基本的操作始于用脂质修饰的寡核苷酸修饰细胞膜,然后将它们流过具有互补DNA序列图案的底物。细胞仅在找到互补DNA序列的地方选择性地粘附在底物上。非贴壁细胞被冲走,露出贴壁细胞的模式。其他操作包括进一步的细胞 - 底物或细胞 - 细胞粘附,以及将DPAC形成的模式转移到嵌入水凝胶中以进行长期培养。以前,在表面上对寡核苷酸进行图案化和用DNA序列修饰细胞的方法分别需要专门的设备和定制的DNA合成。我们报告了该协议的更新版本,利用廉价的台式光刻设置和使用模块化格式部署的商用胆固醇修饰寡核苷酸(CMO)。CMO标记的细胞高效地粘附在DNA图案的底物上。这种方法可用于以高精度同时对多种细胞类型进行图案化,并创建嵌入细胞外基质中的微组织阵列。该方法的优点包括其高分辨率,能够在不破坏微模式的情况下将细胞嵌入三维微环境中,以及灵活地对任何细胞类型进行图案化。
细胞在组织中相对于彼此的位置是微环境1,2,3,4的重要特征。用于将活细胞模式化为空间控制排列的技术是研究分化4,5,6,7,8,细胞运动9,形态发生10,11,12,代谢13和细胞 - 细胞相互作用的宝贵实验工具7,14.细胞图案化的方法多种多样,每种方法各有优缺点3、4。创建细胞外基质(ECM)蛋白粘合岛的方法,如微接触打印和激光切割模板,简单且可扩展。然而,很难一次对一种或两种以上的细胞类型进行模式化,因为不同细胞类型对不同ECM分子的粘附特性通常相似15,16,17。更复杂的微图案可以用光诱导分子吸附(LIMAP)创建,这是一种使用紫外光消融PEG包被区域并允许随后蛋白质吸附的技术18,19。可以重复此过程以创建具有多种细胞类型的高分辨率微图案。然而,细胞与不同蛋白质贴片的交叉结合可能发生,导致模式特异性差19。物理方法,如将细胞接种到微机械可重构培养装置上,可以创建具有动态控制的结构化共培养物,但没有微接触打印或LIMAP14,8的图案设计的灵活性。与其他技术不同,生物打印可以在水凝胶20,21内创建细胞的三维排列。然而,生物打印结构的分辨率远低于其他微图案化技术,平均特征大小约为数百微米22。理想的细胞图案化方法将具有高分辨率,对多种细胞类型进行模式化,使用易于访问的设备和试剂,并且能够将成功的图案嵌入到水凝胶中以进行三维(3D)细胞培养。在本文中,我们介绍了CMO-DPAC,这是一种细胞微图案化技术,它利用DNA杂交的灵活性和速度来靶向细胞粘附到底物上。这种方法已经从我们以前的协议23,24中进行了改编,使其更实惠,模块化和可访问。使用当前的协议,任何实验室都应该能够在没有任何专业设备或专业知识的情况下建立一个功能齐全的系统。
DNA细胞程序组装(DPAC)是一种强大的组织工程技术,可以对细胞以单细胞分辨率对细胞进行模式处理,并精确控制细胞间距和组织几何形状。在DPAC中,细胞膜用DNA寡核苷酸(寡核苷酸)装饰,使用两种脂质修饰的寡核苷酸,旨在在细胞膜上杂交。由于寡核苷酸与疏水性脂质偶联,因此它们迅速分配到细胞膜25,在那里它们杂交,增加了非共价结合分子的净疏水性,从而增强了它们在细胞表面26的寿命。寡核苷酸以一种可以与其他细胞或DNA功能化的载玻片上的互补寡核苷酸杂交的方式呈现在细胞表面上,以创建具有规定组合物,细胞间距和几何形状23,24的定义的2D或3D细胞图案。图案化的微组织可以通过酶从表面上切除并嵌入到水凝胶中以延长3D培养。当与原代细胞或干细胞结合使用时,所得的细胞集合可以进行形态发生并形成类器官23,27,28。DPAC已被应用于研究成体神经干细胞命运的动力学,以响应竞争信号6,29,研究乳腺上皮细胞23,28的自组织,并通过间充质凝聚产生"组织折纸"27。
DPAC允许精确放置多个细胞群,并且具有比基于挤出的生物打印机(微米级)更好的分辨率22,23。此外,与基于ECM的图案化方法(例如微接触印刷)不同,DPAC不需要不同细胞类型对ECM涂层表面的差异粘附15,23。它非常适合回答有关组织组成如何影响其行为,细胞在做出决定时如何整合多个细胞和微环境线索6,29以及成对的细胞如何相互作用的问题。与其他微模式方法相比,该方法的一个优点是它可以用于单个成像平面上的3D细胞培养,便于组织自组织和类器官形态发生23,27,30的延时研究。
尽管有这些优势,但DPAC的成功实施需要合成定制的寡核苷酸试剂和获得用于DNA图案的专用设备23,24,限制了广泛采用。例如,原始方案中使用的最佳脂质修饰寡核苷酸(LMO)必须定制合成,用木质素或棕榈酸修饰,并纯化26。该过程需要使用DNA合成器和高效液相色谱仪,以及购买相关试剂,如甲胺,这是一种受机构和联邦法规约束的受控物质。作为替代方案,改性活生物体可以批量定制购买,但这需要对该技术进行大量的前期投资。
为了克服这些限制,我们开发了DPAC的修订版,使用市售的胆固醇修饰寡核苷酸(CMO)代替定制合成的改性活生物体。为了进一步降低成本并提高平台的灵活性,我们改用模块化的三寡核苷酸系统。该协议的用户可以为每个细胞群使用相同的胆固醇修饰寡核苷酸("通用锚"和"通用共锚"),然后采用廉价的,未修饰的寡核苷酸("适配器链"),与通用锚和表面上的胺功能化DNA或另一种细胞类型的适配器链杂交,而不是为每个独特的细胞群订购新的胆固醇修饰寡核苷酸。
原始DPAC协议的另一个限制是它通过使用高分辨率液体打印机(例如,Nano eNabler,BioForceNanosciences)23,24创建DNA图案的载玻片。虽然该仪器具有非凡的分辨率和低试剂要求,但大多数机构都无法使用,并且打印速率相对较低(每秒约1个特征图案)。最近,已经开发了两种光刻方法,以将DNA特征图案化到表面上。Viola及其同事使用聚丙烯酰胺和二苯甲酮涂层,在暴露于紫外光30时共价结合单链DNA寡核苷酸。使用这种方法,他们能够创建由于细胞收缩性和自组织而经历大规模,程序化形状变化的组织支架。Scheideler等人开发了一种方法,该方法使用阳性光刻胶的紫外线照射选择性地将胺修饰的DNA寡核苷酸暴露于醛官能化载玻片29。在烘烤和还原胺化后,胺修饰的DNA与表面共价结合。该方法用于研究成体神经干细胞对空间呈现的自我更新和分化线索的反应。本文改编了Scheideler等人的协议,以创建将捕获CMO标记细胞的DNA模式。这种光图案协议可以在不使用洁净室的情况下执行。它使用廉价且市售的设备,可轻松部署在台式或通风橱上。使用廉价或DIY(自己动手)的光刻设备增加了无法获得洁净室设施的研究人员的可及性,并允许研究人员尝试该技术而无需投入大量时间或资源31,32。然而,通过使用洁净室设施中常见的商业旋转涂布机和掩模矫正器,可以实现更好的分辨率和多种DNA特征的对齐。
在这里,我们描述了一种使用基于DNA的粘附以单细胞分辨率对细胞进行模式的方法。首先,使用正向光刻胶进行光图案处理,以在醛修饰的玻璃基板上创建胺修饰DNA的高分辨率图案。接下来,对载玻片进行处理以减少非特异性细胞附着,并创建PDMS流通池以将细胞限制在图案化区域上。然后用短DNA寡核苷酸标记细胞,这些寡核苷酸被胆固醇功能化,并因此插入细胞膜。然后将细胞流过DNA微图案。细胞表面DNA和玻璃表面上的DNA之间的杂交导致细胞对DNA模式的特定粘附。非贴壁细胞被冲走,露出贴壁细胞模式。可以重复此过程以对多种细胞类型进行模式化或创建多层结构。如果需要,可以将细胞完全嵌入ECM中进行3D细胞培养。
1. 设计实验
2. 醛功能化载玻片上的光模式DNA(方案改编自Scheideler等人29)
3.使幻灯片疏水(可选)(协议改编自Todhunter等人24)
注意:修改载玻片的表面化学性质以使其更具惰性和疏水性是有利的,但不是必需的。非特异性细胞附着在这些表面上被减少33,从而减轻细胞与载玻片中无图案区域的非特异性结合。此外,如果图案化的细胞最终将嵌入水凝胶中并从载玻片中转移出来,则表面处理对于载物中载有细胞的水凝胶在载玻片上的可靠移动而不会变形或撕裂至关重要。用(十三氟-1,1,2,2-四氢辛基)二甲基氯硅烷进行硅烷化导致载玻片表面上存在疏水性氟烷基。
注意:从 3.1 开始,在化学通风橱中执行所有步骤,以防止暴露于乙酸和二氯甲烷烟雾中。
4. 准备PDMS流通池和载玻片进行实验
注:矩形PDMS流通池用于将细胞集中在载玻片的图案化区域上。对于在3D中培养的实验,流通池形成水凝胶的模具。
5. 用胆固醇修饰的DNA提升和标记细胞
6. 对DNA标记的细胞进行图案化
7.转移到水凝胶中进行3D培养(可选)
8. 使用 CMO 确认电池成功标记(可选,用于故障排除)
该协议使得在2D和3D中以高精度对细胞进行图案化成为可能,而无需使用定制试剂或昂贵的洁净室设备。 图 1 显示了该协议的概述。首先,DNA功能化的载玻片是通过光刻创建的。接下来,用CMO标记单元。然后将细胞流过载玻片,在那里它们仅附着在载玻片的DNA功能化区域。在多余的细胞被冲走后,显示所需的细胞模式。这些细胞可以在载玻片上培养或嵌入含有DNA酶的水凝胶中,然后从载玻片上转移用于3D细胞培养。
用CMO标记细胞允许它们附着在DNA图案化的载玻片上(图2)。首先,胆固醇修饰的通用锚链与适配器链预杂交。接下来,将通用锚点+适配器溶液与细胞悬浮液以1:1混合。通用锚+适配器复合物上的胆固醇插入细胞膜。添加胆固醇修饰的通用共锚链,其与通用锚链杂交,通过增加复合物26的净疏水性来提高CMO复合物在细胞膜中的稳定性。从细胞悬浮液中洗出多余的DNA后,细胞在载玻片上流动。适配链和表面DNA链之间的杂交导致细胞附着在载玻片的DNA图案区域上。
通过使用光刻技术将胺修饰的DNA寡核苷酸附着在醛修饰的载玻片29 的特定区域(图3A)中,可以创建细胞的图案。将正性光刻胶旋转涂覆到醛功能化载玻片上。然后将透明光掩模放置在载玻片的顶部,并将载玻片暴露在紫外线下。显影后,暴露于紫外线的载玻片区域不再涂覆在光刻胶中,因此具有暴露的醛基团。然后将20μM的胺修饰DNA寡核苷酸溶液滴到载玻片上并扩散以覆盖图案化区域。烘烤后进行还原胺化,导致胺修饰的DNA和载玻片之间产生共价键。值得注意的是,该过程可以重复以对多个寡核苷酸进行模式化,而不会损失先前模式化的寡核苷酸的功能(图3B)。但是,应注意避免重叠模式,这导致两种寡核苷酸在降低浓度下的存在(补充图3)。通过使用在其模块化结构域(最接近3'端的20个碱基)中不同的适配器链,可以按顺序对多个细胞群进行模式化。
尽管这种光图案方案是由Scheideler等人在洁净室的背景下开发的,但我们已经证明,使用廉价的"自制"光刻设置可以实现类似的结果,该设置很容易安装在化学通风橱中。该设置包括一个由直流电机,数字控制器和CD蛋糕盒制成的400美元旋转涂布机,以及一个由单个组件组装并装在重新利用的尖锐容器中的UV灯(补充图1)。自制光刻设置的主要优点是它非常实惠(所有设备<1000美元),同时仍然能够创建单细胞大小的功能。然而,使用廉价设备确实有其局限性 - 例如,在不使用掩模对齐器的情况下精确对齐基准标记以图案化多个DNA寡核苷酸更具挑战性。我们建议将这种廉价的光刻设置用于无法方便进入洁净室或希望在没有大量投资的情况下尝试这种方法的实验室。
为了确定DNA编程细胞粘附的最佳条件,我们系统地改变了细胞表面上DNA链的浓度,并测量了细胞粘附到DNA修饰的玻璃表面的效率。标记溶液中通用锚+适配器链和通用共锚的浓度在几个数量级上变化(图4A,B),导致每个细胞10个4 -10 6个DNA复合物(补充图4)。细胞粘附是剂量依赖性的,当细胞以0.05μM或更低的浓度标记CMO时,细胞对DNA模式的粘附最小,并且在浓度为2.5μM或更高的浓度下具有高占用性。因此,我们在大多数实验中使用了通用锚固+适配器绞线的2μM溶液和通用共锚的2μM溶液。如果玻璃表面上使用的DNA量减少29,或者如果适配器链和表面链之间的不匹配增加,则细胞粘附力也会降低。有关适配器链序列设计的详细信息,请参见补充文件 2。使用不含CpG重复序列的适配器链进行CMO标记不会刺激表达小鼠TLR9的HEK细胞中的TLR9(补充图5)。
我们提供了一些证明,即修订后的方案提供了可重复且有效的DNA程序化细胞粘附。例如,用CMO标记的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)高效地粘附在DNA模式上。CMO标记的HUVECs以及LMO标记的HUVECs(图5A)。使用CMO-DPAC模式化的细胞保留了其活力和功能。用CMO标记的细胞用钙黄绿素AM和乙锭同源二聚体染色以评估活力(补充图6)。与未标记的对照细胞相比,活力的差异很小(94%对97%)。通过CMO-DPAC模式化并转移到基质胶中的单个MDCK能够在培养5天后正确增殖和极化(图5B)。DPAC还提供了一种将细胞模式阐述到第三维的方法(图5C)。例如,多层,多细胞聚集体可以通过交替标记有互补CMO的细胞层来创建(图5C)。这些实验表明,该协议是可重复的,不会对细胞活力或功能产生负面影响,并且产生可以在3D ECM的单个成像平面内成功培养的细胞模式。
通过提供正交DNA序列来指导细胞粘附,DPAC提供了一种在单个表面上对多种细胞类型进行图案化的方法。为了实现DPAC的这一特征,光刻产生的DNA图案必须彼此对齐。沉积在载玻片上的金属信托标记允许对准多个光掩模,从而同时对准多种细胞类型。用不同独特染料染色的MCF10As用正交CMO标记并图案化以创建加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校徽标的可视化(图6)。该实验表明,多个独特的细胞群可以高精度地图案化在一起,而不会交叉污染。
使用CMO-DPAC成功对细胞进行图案化需要高质量的光刻,细胞表面上足够浓度的寡核苷酸,图案上的高密度细胞以及足够的洗涤。这些步骤中的任何一个失败都会影响最终结果。补充图2包括正确和不正确的光刻图像的示例图像(补充图2A),图案上所需的细胞密度以创建完全占用的图案(补充图2B),由于在DPAC的后续步骤中过度大力移液而导致的图案化细胞的损失(补充图2C),以及不希望的细胞聚集(补充图2D)。表 1包含常见故障点列表和建议的故障排除方法。建议使用荧光互补寡核苷酸作为故障排除工具,以通过流式细胞术确认载玻片上是否存在图案化DNA以及细胞表面是否存在CMO(参见实验方案的步骤8)。
图1:CMO-DPAC协议概述。 首先,通过用正光刻胶涂覆醛功能化的载玻片,用所需图案的透明掩模覆盖它,并将其暴露在紫外线下,从而创建DNA图案的载玻片。紫外线暴露的光刻胶被显影剂洗掉,留下醛载玻片的暴露区域,并允许胺官能化DNA与表面结合。然后用CMO标记细胞并流过表面。细胞膜上的DNA与表面的DNA杂交,导致粘附。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2:在逐步过程中用CMO标记细胞。 首先,胆固醇修饰的通用锚链与适配器链预杂交。接下来,将通用锚点+适配器溶液与细胞悬浮液混合。通用锚+适配器复合物上的胆固醇插入细胞膜。孵育后,将胆固醇修饰的通用共锚链添加到细胞悬浮液中,在那里它与通用锚链杂交并插入细胞膜。第二胆固醇分子的加入增加了DNA复合物的净疏水性,并将其稳定在膜26内。洗掉多余的DNA后,将细胞浓缩并添加到图案表面顶部的PDMS流通池中。适配链的3'末端与载玻片上的表面DNA链杂交,从而在具有互补DNA功能的区域中特异性地粘附到载玻片上。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3:光刻用于创建DNA图案的载玻片,最终决定细胞的位置。 (A) 光刻工艺概述。醛功能化载玻片用正向光刻胶旋涂。紫外线通过透明光掩模照射到载玻片上,该光掩模在需要细胞粘附的地方是透明的。显影片后,以前暴露在紫外线下的区域现在已经暴露了醛基团。然后将20μM胺官能化DNA寡核苷酸溶液滴到载玻片上并铺展到图案化区域。然后将载玻片烘烤以诱导胺基和醛基之间形成希夫键(C = N),可逆共价键29。随后在PBS中使用0.25%硼氢化钠的还原胺化通过还原胺将希夫碱转化为仲胺,从而在DNA和载玻片之间产生不可逆的键。然后可以通过用丙酮冲洗来除去剩余的光刻胶。(B)这个过程可以重复以创建多组分DNA模式,从而对多个细胞群进行实验。(i)在第一个寡核苷酸图案化后,载玻片再次涂覆在光刻胶中,并且方案像以前一样进行。使用信托标记对照光掩模对于多条DNA链的图案化是必要的。(ii) 每种被图案化的细胞类型在适配器链的20碱基模块化结构域中都不同。通过使用正交的互补寡核苷酸集,可以在没有交叉粘附的情况下对多种细胞类型进行图案化。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4:CMO标记的细胞对DNA模式的粘附在标记过程中随着CMO浓度的函数而增加。 在该实验中,通用锚+适配器链(预杂交)和通用共锚在相同浓度下使用。浓度是指在细胞的CMO标记过程中细胞悬浮液中CMO的浓度。(A)定量CMO标记的MCF10A细胞占据的15μm直径DNA斑点的百分比,作为细胞标记期间CMO浓度的函数。表示为三个实验的平均±标准偏差的数据。(B)不同浓度的CMO下DNA模式(品红色)和粘附的MCF10As(青色)的代表性图像。比例尺 = 100 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图5:CMO-DPAC可用于创建二维细胞图案,随后可以嵌入到三维水凝胶中进行培养和/或分层以创建多层结构。 (A) CMO标记的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和LMO标记的HUVECs之间的直接比较,这些细胞粘附在线性DNA模式上。这两种细胞标记方法都导致DNA模式的几乎100%占用率。(B)表达H2B-RFP的单个Madin-Darby犬肾细胞(MDCKs)被图案化到直径为15μm的斑点上,间隔200μm,随后嵌入Matrigel中。培养120小时后,固定所得上皮囊肿并染色E-钙粘蛋白,肌动蛋白和胶原IV。白色框中的旋转椭球体详细显示。(C)多层细胞结构可以通过用互补的适配链标记单独的细胞群并按顺序进行图案化来创建,以便每个新添加的细胞附着在它之前的细胞层上。(i) 细胞群的顺序图案化示意图,以创建多层结构。(二)使用该过程创建了MCF10As的三层细胞聚集体(使用染料可视化)。比例尺 = 50 μm。 请单击此处查看此图的放大版本。
图6:可以对多种细胞类型进行图案化,而不会交叉污染或失去附着力。 将多个胺修饰的DNA寡核苷酸依次图案化到醛载玻片上,并通过使用金属信托标记物对齐。MCF10As的三个群体(青色,品红色,黄色)被涂上标有互补CMO的独特染料,并图案化在幻灯片上,从而产生加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校徽标的图像。比例尺 1 mm。 请单击此处查看此图的放大版本。
补充图1:台式光刻设置的示例图像。(A)在旋涂机上滑动,用正向光刻胶覆盖,然后旋涂。(B) 透明光掩模的图片。(C) 在曝光过程中,光掩模夹在涂有光刻胶的载玻片和玻璃盘之间。(E) 幻灯片浸入显影剂解决方案中。(F) 开发幻灯片。(G)胺修饰的DNA溶液扩散到载玻片的图案化区域。(H) PDMS 流通池放置在载玻片的图案化区域的顶部。 请点击此处下载此文件。
补充图 2:此协议常见故障的一些示例。 (A) (i) 在紫外线照射前进行烘焙不足或暴露后过度显影的特征可能导致特征边缘呈锯齿状,并且尺寸可能不规则。(ii) 正确照相图案的幻灯片示例,其特征周围具有干净的边缘、均匀的特征大小以及图案中没有明显的裂缝。比例尺 = 50 μm.(B)细胞密度对图案化效率至关重要。当在显微镜下观察图案顶部的细胞时,细胞之间应该存在很少的间隙,如左侧的示例图像所示。(C)图案化细胞可能对过度剧烈移液产生的流体力敏感,这可能会损坏和移液模式细胞。多层细胞聚集体特别脆弱,因为底部的一个细胞支撑着多个细胞的结构。(i) 一组细胞聚集体成功嵌入到基质胶中。(ii) 由于过于剧烈地移液粘性基质胶而移出的细胞聚集体网格。(D)可能发生细胞聚集,特别是上皮细胞。这些团块通常是同型的,但如果细胞特别粘稠,则可能是异型的(细胞粘附在已经形成图案的不同类型的细胞上)。图像显示,三个不同的MCF10As群体被图案化到由三个不同的单细胞大小的DNA斑点(15μm)组成的阵列上。大多数DNA斑点附着2-4个细胞。结块可以通过EDTA处理或在图案化之前过滤掉团块来解决。比例尺 = 100 μm。 请点击此处下载此文件。
补充图3:重叠的光模式导致两种寡核苷酸在降低浓度下的存在。 两个正交的胺修饰寡核苷酸依次光图案化,首先是一条垂直线(链1),然后是一条与之重叠的水平线(链2)。然后通过与荧光互补寡核苷酸杂交来可视化寡核苷酸。(A) 第1条链的荧光图像。(B) 在跨越重叠的 100 μm 垂直线上定量链 1 的荧光分布。(C) Strand 2 的荧光图像。(D) 在跨越重叠的 100 μm 水平线上定量 Strand 2 的荧光分布。比例尺 = 50 μm。 请点击此处下载此文件。
补充图4:细胞表面DNA复合物的定量作为CMO标记浓度的函数。 用不同浓度的CMO溶液标记HUVECs,洗涤,然后用荧光互补链孵育。使用MESF(等效可溶性荧光染料分子)微球试剂盒进行定量流式细胞术,并估计细胞表面DNA复合物的数量作为标记期间CMO浓度的函数。 请点击此处下载此文件。
补充图5:CMO标记不会刺激TLR9反应。 进行了一项实验,以观察CMO标记是否会触发TLR9的DNA检测机制,以及这是否会受到适配器链序列中CpG的影响。将表达小鼠TLR9的HEK细胞与0.2μM的ODN 1826(含CpG的TLR9激动剂),CMO通用锚+通用共锚+适配器链(含有与ODN 1826(CMO-CpG)相同的序列)或CMO通用锚定+通用共锚+适配器链孵育过夜,但用GpC(CMO-GpC)替换CpG。TLR9刺激将导致SEAP(分泌的胚胎碱性磷酸酶)的产生。SEAP分泌通过比色法(吸光度)量化。将治疗条件与仅用PBS治疗的静息细胞进行比较。与CMO-GPC孵育没有刺激TLR9表达。用CMO-CpG孵育略高于静息细胞,但远低于ODN-1826。 请点击此处下载此文件。
补充图6:CMO标记过程后细胞的活力。为了评估方案如何影响可行性,HUVECs被分成四个群体:一个在冰上停留1小时,一个用PBS模拟标记,但通过所有离心机和洗涤步骤,一个用CMO标记,一个用CMO标记并通过40μm过滤器过滤以除去团块。然后用钙黄绿素AM和乙锭同源二聚体染色细胞以评估活细胞和死细胞的数量。与冰对照相比,所有处理的生存能力显着降低(使用Tukey事后分析的单因素方差分析),但CMO标记(有或没有过滤)的中位生存能力约为94%。从三个独立实验中收集的数据。* = p < 0.05。= p < 0.0001 请单击此处下载此文件。
结果 | 可能的原因 | 建议的修复程序 |
光刻 – 特征被破解 | 软烘焙不一致或不充分 | 增加软烤时间至3分钟;验证电炉的实际温度,并根据需要提高温度 |
光刻 – 特征不清晰或有光刻胶残留在其中 | 开发中 | 增加幻灯片在开发人员解决方案中花费的时间;加入温和的搅拌 |
光刻 – 幻灯片上的特征不一致 | 紫外线可能未居中或未正确聚焦 | 调整紫外光设置,确保准直光强度均匀 |
细胞不会高效率地粘附在图案斑点上 | 表面上没有足够的DNA | 通过将载玻片与荧光互补寡核苷酸杂交,然后在显微镜下成像,确认DNA存在于表面上 |
细胞未充分标记CMO | 将荧光互补寡核苷酸添加到细胞悬浮液中,并通过流式细胞术确认荧光 | |
没有足够的单元格超过模式 | 通过从PDMS流通池中洗出来收集细胞,离心并以较低的体积重新悬浮以浓缩细胞 | |
细胞悬浮液中剩余的CMO过多,与载玻片上的DNA杂交 | 再加一个洗涤步骤。确保在每次洗涤时尽可能多地去除上清液。 | |
由于时间和温度的原因,CMO的内化程度过高 | 用CMO标记细胞后快速工作;保持细胞并在冰上滑动,并使用冰冷的试剂 | |
细胞团块 | 胰蛋白酶消化过程中细胞未充分分离 | 在细胞洗涤过程中使用PBS + 0.04%EDTA;在最终洗涤之前将细胞悬浮液通过35μm过滤器 |
细胞粘附非特异性 | 如果在一个特定区域 - 可能是由于载玻片上的划痕,PDMS流通池的错位或DNA溢出到图案区域之外 | 避免划痕,小心将PDMS流通池与图案区域对齐 |
如果细胞粘附在任何地方 - 阻塞或洗涤不足 | 在细胞图案化后添加更多的洗涤剂;在洗涤过程中更积极地移液;在开始细胞图案化之前,用1%BSA阻断更长时间;硅烷化载玻片(可选步骤3)或通过测量水滴的接触角确认硅烷化成功 | |
流通池内形成气泡 | 移液错误,等离子体氧化过程中产生的不均匀亲水表面 | 如果气泡很小,请将PBS添加到流通池的入口处,它们可能会被洗掉。如果气泡较大,请对PDMS流通池施加轻柔的压力,将气泡推向入口或出口。 |
细胞最初粘附于模式,但在洗涤,其他细胞类型的图案化或添加水凝胶前体期间被移除 | 移液过猛的剪切力会导致细胞从表面脱落 | 在随后的洗涤、细胞图案化或添加水凝胶前体的过程中,更轻柔地移液。由于水凝胶前体是粘性的,因此它们更容易导致图案脱落,因此请格外小心。多层结构往往头重脚轻,更容易被移位。 |
3D 传输过程中的组织变形 | 水凝胶粘在滑动上 | 使用接触角测量确认载玻片的疏水性 |
使用剃须刀片将PDMS完全抬起两个边缘,使PBS漂浮在组织下方 | ||
纯胶原蛋白水凝胶可能会发生这种情况 - 考虑调整蛋白质浓度或水凝胶的组成 | ||
细胞不与水凝胶一起转移并保持在载玻片上 | 增加涡轮DNA酶浓度或增加孵育时间 | |
水凝胶不够坚固 | 增加相关水凝胶的孵育时间和/或凝胶机制(例如,对于胶原蛋白,请确保pH值正确) | |
去除 PDMS 时的水凝胶撕裂 | 在开始实验之前,使用等离子体氧化使PDMS流通池亲水,以便在添加培养基时轻松分离。轻轻地使用镊子来分离 PDMS。 |
表 1:用于识别和解决此协议可能产生的潜在故障的疑难解答指南。 特别是,细胞对模式的粘附力差可能有许多根本原因,本指南应有助于识别和解决这些问题。
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补充文件 4.请点击此处下载此文件。
在本文中,我们提出了用于体外细胞培养实验的2D和3D细胞高分辨率图案化的详细方案。与以前发表的该方法版本不同,此处介绍的协议侧重于可用性:它不需要高度专业化的设备,并且所有试剂都可以从供应商处购买,而不需要定制合成。与其他细胞微模式方法不同,该方法是快速且与细胞类型无关的:它不需要对细胞外基质蛋白的特异性粘附15。由CMO-DPAC图案化的细胞可以嵌入细胞外基质(例如基质胶或胶原蛋白)中,从而产生比目前基于挤出打印的方法22更高的空间分辨率的3D培养物。CMO-DPAC可用于为每个载玻片创建数百到数千个微观特征,从而允许同时执行许多复制。
该协议成功的最重要参数之一是添加到图案化载玻片顶部的流通池的细胞密度。理想情况下,密度应至少为2500万个细胞/ mL。当加载到流通池中时,这种细胞密度导致图案上方的细胞几乎紧密堆积的单层细胞(补充图2B)。这些高细胞密度最大限度地提高了细胞直接沉降在DNA斑点顶部并粘附的可能性。降低细胞密度将降低整体图案化效率。该协议中的另一个关键步骤是在添加CMO溶液之前将细胞完全重新悬浮在PBS或无血清培养基中。CMO非常迅速地分配到细胞膜中,并将CMO溶液直接添加到细胞沉淀中将导致细胞的非均质标记。将CMO溶液添加到细胞悬浮液中后,重要的是通过移液彻底混合,以便细胞与CMO均匀标记。孵育后,有必要通过多次离心和洗涤步骤彻底洗掉多余的CMO。细胞悬浮液中存在的过量游离CMO将与载玻片上的图案化胺修饰DNA结合,阻断悬浮液中CMO修饰细胞的杂交和粘附。时间也是该协议的关键考虑因素。在使用CMO时,尽快工作并保持细胞在冰上以尽量减少CMO的内化并最大限度地提高细胞活力非常重要。流式细胞术实验表明,CMO在细胞表面的持久性不如改性活生物体长,在冰上孵育两小时后,CMO复合物损失25%36。此外,随着细胞处理时间的增加,细胞的活力将降低。通过快速工作,将细胞保持在冰上,使用冰冷的试剂以及使用无血清培养基提供一些营养,可以最大限度地提高活力。
尽管CMO-DPAC可以通过高精度对细胞进行图案化来研究细胞生物学,但它确实有其局限性。CMO-DPAC实验可能具有挑战性,特别是当实验复杂性与多种细胞类型,层或3D细胞培养物(补充文件1)一起增加时。启动该协议时,实验失败可能很常见,如表1中所述。因此,我们建议用户进行质量控制检查(确认载玻片上存在DNA,确认细胞已用DNA充分标记(步骤8),确认多余的细胞已被彻底洗去等),以确保实验成功并确定可能需要进一步优化的步骤。我们希望本手稿及其补充文件中提供的信息将有助于促进任何必要的故障排除。
胆固醇是一种生物活性分子,其内化可能影响细胞代谢,基因表达和膜流动性37,38。之前的一项研究比较了使用单细胞RNA测序对CMO和LMO标记细胞基因表达的影响。与未标记和改性活生物标记的细胞相比,CMO标记的HEK细胞改变了基因表达36。使用CMO标记细胞导致相对于未标记对照的八个基因的差异表达(>1.5倍),包括AP2B1,它与胆固醇和鞘脂转运(GeneCards)有关,以及MALAT1,一种调节胆固醇积累的长非编码RNA39。虽然很小,但如果所讨论的实验正在研究细胞中的代谢,膜动力学或其他与胆固醇相关的途径,这些转录反应可能会引起关注。
该协议非常灵活,可以进行调整以满足每个实验的需求。由于CMO将自己插入脂质膜而不是使用任何特定的受体,因此该方法是与细胞类型无关的(HUVECs,MCF10As,HEK和MDCK已在此处得到证明)。尽管胆固醇与我们以前发表的改性活生物体是不同的疏水锚,但到目前为止,我们发现它们的行为相似。因此,我们希望CMO能够与我们之前发表的改性活生物体一起使用的各种细胞类型中的任何一种,包括但不限于神经干细胞,成纤维细胞,外周血单核细胞,肿瘤细胞和原发乳腺上皮细胞6,23,27,29,36 .CMO标记不会刺激TLR9,这表明该协议与免疫细胞兼容。CMO的膜掺入是总细胞大小和糖萼35细胞中负电荷程度的函数。因此,我们纳入了一个方案(步骤8),用于测试适合快速优化的膜掺入程度。每种细胞模式的具体特征将不可避免地因实验设计而异(参见补充文件1以获取更多指导)。尽管推荐使用上述用于DNA图案化的光图案化方案,但任何在空间上限制胺-DNA溶液液滴的方法都应该有效,例如使用高分辨率液滴打印机。图案分辨率和最小特征间距将因所使用的方法而异。从理论上讲,也可以将该协议的DNA光图案部分与用于用DNA标记细胞的其他方法相结合,例如使用与膜表达的锌指40杂交的DNA,使用NHS偶联DNA41,以及将细胞表面的叠氮基唾液酸残基与磷化氢偶联DNA42反应.CMO-DPAC可以应用于需要严格控制细胞间距的各种实验,包括研究细胞对之间的相互作用,共同培养实验,观察信号从"发送者"细胞到"接收者"细胞的转移,以及研究附近细胞外线索对干细胞分化的影响6,29.该方法还可用于创建微组织,可用于研究三维的细胞迁移,细胞自组织到组织中23,27,以及细胞与ECM27之间的动态相互作用。我们希望该协议将为研究人员提供一个可访问的平台,以探索基于高分辨率DNA的细胞图案化在他们自己的实验室中的新应用。
Z.J.G.是Provenance Biosciences的顾问和股东。
作者要感谢Jeremy Garcia测试该协议,Bhushan Kharbikar在UCSF生物医学微技术和纳米技术核心提供设备培训。这项研究部分得到了国防部乳腺癌研究计划(W81XWH-10-1-1023和W81XWH-13-1-0221),NIH(U01CA199315,DP2 HD080351-01,1R01CA190843-01,1R21EB019181-01A和1R21CA182375-01A1),NSF(MCB1330864)和UCSF细胞构建中心(DBI-1548297)的资助。O.J.S.由NSF研究生研究奖学金,Siebel奖学金和P.E.O.奖学金资助。Z.J.G和A.R.A.是Chan-Zuckerberg BioHub调查员。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | Thermo Fisher Scientific | 155379 | |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Adapter with External SM1 Threads and Internal SM3 Thread | ThorLabs | SM3A1 | |
Aldehyde Functionalized Slides | Schott | Nexterion Slide AL | Store under dry conditions after opening. |
All Plastic Syringes, 1 mL | Fisher Scientific | 14-817-25 | |
Amine-Modified DNA Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Aspheric Condenser Lens | ThorLabs | ACL7560 | |
Borosilicate Disc, 6in Diameter X 1/2in Thick | Chemglass | CG-1906-23 | |
Cell Culture Dishes 60x15 mm style | Corning | 353002 | |
Cholesterol-Modified Oligo | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
Diamond Scribe | Excelta | 475B | |
DNA Oligonucleotide | IDT | n/a | See Supplemental File 1 for suggested sequences. |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | |
Isopropyl Alcohol | Sigma-Aldrich | 278475 | |
Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
Methylene Chloride (Stabilized/Certified ACS) | Fisher Scientific | D37-4 | |
MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Microposit S1813 Positive Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | |
Ø3" Adjustable Lens Tube, 0.81" Travel | ThorLabs | SM3V10 | |
Oven | Thermo Scientific | 51-028-112H | |
PE-50 Compact Benchtop Plasma Cleaning System | Plasma Etch | PE-50 | |
Photomask (custom) | CAD/Art Services | n/a | Minimum feature size guaranteed by CAD/Art Services is 10 microns. |
Razor Blades | Fisher Scientific | 12-640 | |
RCT Basic Hot Plate | IKA | 3810001 | |
Silicon Wafer (100 mm) | University Wafer | 590 | |
Sodium Borohydride, 98%, granules | Acros Organics | 419471000 | |
Spin Coater Kit | Instras | SCK-200 | This is a low cost option, but any spin coater that can maintain a speed of 3000 rpm will suffice. |
SU-8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
SU-8 Developer | Microchem | Y020100 4000L1PE | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow | 2646340 | |
Syringe Needles | Sigma-Aldrich | Z192341 | |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | ThorLabs | LEDD1B | |
Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl dimethylchlorosilane | Gelest | SIT8170.0 | |
Triethylamine | Sigma-Aldrich | 90335 | |
Turbo DNase | Thermo Fisher Scientific | AM2238 | |
Tweezers Style N7 | VWR | 100488-324 | The curved shape of these tweezers is essential for delicately picking up the PDMS flow cells containing patterned tissues. |
UV LED (365 nm, 190 mW (Min) Mounted LED, 700 mA) | ThorLabs | M365L2 | |
Wafer Tweezers | Agar Scientific | T5063 | |
WHEATON Dry-Seal vacuum desiccator | Millipore Sigma | W365885 |
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