Un modello di ratto sprague Dawley ortotopico singenico con amputazione per controllare il tasso di metastasi

Riepilogo

Qui, viene descritto un impianto ortotopico singenico seguito da una procedura di amputazione dell'osteosarcoma con metastasi polmonari spontanee che può essere utilizzato per l'indagine preclinica della biologia delle metastasi e lo sviluppo di nuove terapie.

Abstract

Il più recente progresso nel trattamento dell'osteosarcoma (OS) si è verificato nel 1980 quando la chemioterapia multi-agente ha dimostrato di migliorare la sopravvivenza globale rispetto alla sola chirurgia. Per affrontare questo problema, lo scopo dello studio è quello di perfezionare un modello meno noto di OS nei ratti con un approccio chirurgico istologico, di imaging, biologico, di impianto e amputazione completo che prolunga la sopravvivenza. Abbiamo usato un modello di ratto singenico Sprague-Dawley (SD) immunocompetente e surclassato con linea cellulare UMR106 OS impiantata (proveniente da un ratto SD) con impianti di tumore tibiale ortotopico in ratti maschi e femmine di 3 settimane per modellare il sistema operativo pediatrico. Abbiamo scoperto che i ratti sviluppano tumori polmonari primari e metastatici riproducibili e che le amputazioni degli arti a 3 settimane dopo l'impianto riducono significativamente l'incidenza di metastasi polmonari e prevengono morti inaspettate. Istologicamente, le OS primarie e metastatiche nei ratti erano molto simili alla OS umana. Usando metodi immunoistochimici, lo studio mostra che la OS di ratto è infiltrata con macrofagi e cellule T. Un'indagine sull'espressione proteica delle cellule OS rivela che questi tumori esprimono chinasi della famiglia ErbB. Poiché queste chinasi sono anche altamente espresse nella maggior parte dei sistemi operativi umani, questo modello di ratto potrebbe essere utilizzato per testare gli inibitori della via ErbB per la terapia.

Introduzione

L'osteosarcoma (OS) è il tumore osseo primario più comune nei bambini, negli adolescenti e nei giovani adulti. Il più recente progresso nel trattamento della OS si è verificato nel 1980 quando la chemioterapia multi-agente ha dimostrato di migliorare la sopravvivenza globale rispetto alla sola chirurgia¹. La OS si sviluppa durante la rapida crescita ossea, che si verifica in genere nelle ossa tubolari lunghe come femore, tibia e omero. Sono caratterizzati da un aspetto osteolitico, osteoblastico o misto con notevole reazione periostale². La chemioterapia e la resezione chirurgica possono migliorare l'esito per i pazienti con una sopravvivenza a 5 anni per il 65% dei^{pazienti 2,3.} Sfortunatamente, i pazienti con OS di alto grado con malattia metastatica hanno una sopravvivenza del 20%. La OS invade a livello regionale e metastatizza principalmente ai polmoni o ad altre ossa ed è più diffusa nei maschi. Il bisogno più impellente per questi giovani pazienti è una nuova terapia che prevenga ed elimini la vitalità delle metastasi a distanza.

I modelli pre-clinici della OS sono stati esaminati^4,5,6,7 e sono stati sviluppati pochi modelli immunocompetenti disponibili che utilizzano l'amputazione della OS ortotopica. Nel 2000, un modello importante è stato sviluppato utilizzando topi BALB / c con OS singenico ortotopico e amputazione⁸. Rispetto a questo modello murino, il modello di ratto si basa su animali geneticamente allevati e 10 volte più grandi che portano ad alcuni vantaggi. Il modello umR106 di ratto è stato sviluppato da un sistema operativo indotto da ³²P in un ratto Sprague Dawley (SD), che è stato derivato in una linea cellulare⁹. Nel 2001, l'impianto ortotopico di UMR106-01 è stato descritto per la prima volta in tibie impiantate di topi atimici con sviluppo rapido e coerente del tumore primario e caratteristiche radiologiche e istologiche in comune con la OS nell'uomo. Le metastasi polmonari si sono sviluppate e dipendevano dal posizionamento ortotopico di UMR106 nel microambiente osseo¹⁰. Nel 2009, Yu et al.¹¹ hanno stabilito un modello di ratto con sistema operativo ortotopico del femore riproducibile utilizzando cellule UMR106 in ratti SD maschi più grandi. Il successo degli impianti tumorali e il tasso di metastasi polmonari nei ratti senza amputazione erano simili ai dati qui presentati. In questo studio, è stata eseguita un'amputazione aggiuntiva al modello utilizzando ratti giovani, il che ha suggerito che i tempi di rimozione del tumore primario sono cruciali nella modellazione della OS, in particolare in relazione alla progressione metastatica. Con questo perfezionamento, l'amputazione e l'imaging in vivo migliorano questo modello per gli studi pre-clinici per la valutazione di nuovi farmaci per la OS.

Protocollo

Tutte le procedure e gli esperimenti che coinvolgono i ratti sono stati eseguiti secondo i protocolli approvati dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.

1. Il protocollo di coltura cellulare UMR-106 della linea cellulare SD rat OS

1. Cellule di coltivazione in DMEM, integrate con il 10% (v/v) di FBS, penicillina (10 U/mL)-streptomicina (10 U/mL) a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO_2. Eseguire esperimenti utilizzando celle con passaggi di 2-8¹².

2. Iniezione intratibiale del protocollo delle cellule OS

NOTA: le ratte SD gravide accoppiate nel tempo partoriscono nella struttura animale e a 3 settimane di età vengono utilizzate cucciolate (poiché la linea cellulare UMR 106 è sinergica con i ratti SD, non è necessaria alcuna irradiazione).

1. Induzione
   1. Posizionare il ratto in una camera di induzione di medie dimensioni e indurre l'anestesia con il 2% -3% di isoflurano. Monitorare continuamente l'animale per la profondità dell'anestesia di riflesso al pizzico della punta, alla frequenza respiratoria e al carattere.
   2. Inserire il naso nel naso. Fissare con nastro adesivo, se necessario.
   3. Rimuovere i peli sulla gamba destra fino all'addome ventrale e dorsale inferiore con tagliacapelli o utilizzare un agente depilatorio. Posizionare il ratto in posizione supina.
   4. Strofinare l'area chirurgica in modo asettico utilizzando etanolo al 70% e diluire clorexidina acetato o betadina diluita. Inizia intorno all'area del ginocchio e strofina con un movimento circolare sia prossimale che distale. Ripetere questo passaggio tre volte. Nessun drappo viene utilizzato per l'impianto del tumore.
   5. Applicare lubrificante per gli occhi in entrambi gli occhi del ratto per prevenire l'essiccazione corneale causata dall'anestesia. Posizionare il topo su una piastra riscaldante a bassa temperatura. Assicurarsi che il ratto abbia una temperatura corporea normale (37 °C) e una frequenza respiratoria normale.
2. Chirurgia
   1. Accendere l'isoflurano a ~ 1,5% -2% (per manutenzione). Assicurarsi che l'animale si trovi su un piano adeguato di anestesia per mancanza di un riflesso del pizzico della punta. In caso contrario, aumentare la percentuale di isoflurano al 2,5%.
   2. Contrassegnare un ago sterile (circa 22 G) a 10 mm dalla punta per la guida della profondità da inserire.
   3. Inserire l'ago 10 mm verso il basso nella diafisi della tibia inserendo il ginocchio piegato nel mezzo del plateau tibiale, estendendo l'ago attraverso la metafisi nella diafisi usando un leggero movimento simile a un trapano per fare un'apertura. Rimuovere l'ago.
   4. Caricare la sospensione cellulare nella siringa Hamilton direttamente prima dell'iniezione nella tibia. Per fare questo, mescolare delicatamente le cellule prima di aspirare nella siringa poiché la gravità fa sì che le cellule si depositino sul fondo del tubo.
      NOTA: le celle possono essere conservate in un tubo da 1,5 a 2 mL (a temperatura ambiente) prima di aspirare nella siringa Hamilton (100 μL) dopo un'attenta miscelazione. Le cellule possono essere mantenute a temperatura ambiente per 2-3 ore durante la procedura di impianto. Controllare sempre la vitalità cellulare delle cellule nel tubo prima e poi dopo la sessione di impianto. L'esclusione blu di trypan è il metodo più semplice per la valutazione della vitalità cellulare.
   5. Una volta attraversato l'osso con il primo ago, inserire un secondo ago (di diametro più piccolo contrassegnato anche a 10 mm) ago attaccato alla siringa Hamilton da 100 μL caricata con cellule. Assicurarsi di inserire l'ago fino al segno di 10 mm nello stesso foro che si estende nella diafisi.
   6. Scaricare delicatamente 20 μL di 75.000 cellule OS in sospensione in PBS nella diafisi e nella cavità midollare.
      NOTA: l'ago non deve oscillare nell'osso e deve sentirsi sicuro. Se l'ago si muove facilmente, la corteccia potrebbe essere stata attraversata alla diafisi. Ripetere nuovamente l'inserimento per ottenere un posizionamento più solido prima dell'iniezione delle cellule.
   7. Rimuovere l'ago hamilton dall'osso.
      NOTA: Se si forma una piccola goccia di sangue, applicare una leggera pressione. Se si forma una chiara goccia di liquido nel sito di puntura, l'ago potrebbe non essere stato esteso abbastanza lontano nell'osso e la sospensione delle cellule tumorali potrebbe essere fuoriuscita attraverso il foro. Registra questo nelle note ma in generale, l'impianto del tumore avrà successo. Con l'esperienza, la procedura di impianto del tumore dovrebbe richiedere 5 minuti per ratto. Con l'esperienza, l'impianto tumorale delle cellule nell'osso diventerà più facile. L'iniezione accidentale di cellule nel muscolo intorno all'osso, non può portare al microambiente tumorale necessario per le metastasi polmonari.
3. Guarigione
   1. Assicurarsi che il ratto sia normotermico. Metti il topo in una gabbia con una piastra riscaldante posta sotto la gabbia per il recupero.
   2. Dopo essere completamente sveglio, mobile e respirando bene, iniettare ai ratti buprenorfina (1,0-1,2 mg/kg SC).
      NOTA: Per ottenere l'accesso alla buprenorfina, verificare con l'istituzione per vedere le opzioni per l'approvazione attraverso il personale veterinario per effettuare l'ordine.
   3. Sposta i ratti in gabbie pulite e monitora una volta al giorno, ogni settimana.

3. Misurazione e monitoraggio

1. Misurare la dimensione del tumore 9-10 giorni dopo l'impianto e poi ogni 2 giorni fino a 3 settimane dopo l'impianto per stabilire un tasso di crescita. Misurare il diametro massimo della tibia utilizzando una pinza elettronica o manuale. Memorizza i dati in un foglio di calcolo con una formula per calcolare il volume del tumore. Misurare la controlaterale (non tibia impiantata) come linea di base.
   NOTA: I diametri degli arti posteriori impiantati sono usati come surrogato per le dimensioni del tumore. Gli arti posteriori sono misurati perpendicolarmente all'asse lungo della tibia al diametro maggiore per due misurazioni, ventrale/dorsale e media/laterale sull'arto. Il volume tumorale stimato è calcolato dalla formula¹¹: Volume tumorale (mm³) = diametro maggiore (mm) x diametro più piccolo (mm)²/2.
2. Considerare i ratti per l'amputazione di sopravvivenza o il trattamento chemioterapico quando i tumori si avvicinano a 15 mm nella dimensione più grande o 3 settimane dopo l'impianto del tumore. L'arto controlaterale misura circa 7-9 mm nella maggior parte dei ratti a questa età.

4. Somministrazione endovenosa di doxorubicina

1. Anestetizzare i ratti con il 2% di isoflurano. Preparare la pelle sulla vena giugulare con tre lavaggi chirurgici usando betadina e alcol come descritto¹³.
2. Sotto un'attenta dissezione, visualizzare la vena giugulare destra o sinistra. Inserire l'ago nel muscolo sovrastante e quindi dirigere verso la testa del ratto nel lume della vena giugulare come viene visualizzato nella vena giugulare anteriore al muscolo pettorale.
   1. Quando l'ago viene inserito nella vena giugulare, prelevare delicatamente il sangue nella siringa per garantire il corretto inserimento. È possibile credere che l'ago sia attraverso la vena, ma l'ago è sotto la vena e non nel lume. Se la vena giugulare diventa troppo piccola per le iniezioni quando si seziona contundente per esporre la vena giugulare, utilizzare l'altra vena giugulare per l'iniezione.
3. Iniettare doxorubicina (2 mg/kg) lentamente per 1 minuto in un volume di 100-150 μL. La soluzione può essere visualizzata per via endovenosa nella vena giugulare durante il parto.
4. Iniettare volumi simili di soluzione salina normale nei ratti di controllo.
5. Rimuovere l'ago e applicare una leggera pressione sulla vena con una garza sterile.
6. Chiudere l'incisione cutanea utilizzando 3-4 clip per ferite. Rimuovere le clip a 7-10 giorni dopo l'iniezione.
   NOTA: i ratti di solito non cercano di rimuovere le clip metalliche, ma mordono e rimuovono le suture. Il metodo di iniezione giugulare è preferibile alle iniezioni della vena della coda per la doxorubicina poiché qualsiasi farmaco che fuoriesce al di fuori del vaso provoca necrosi della coda che può richiedere l'amputazione della coda.

5. Protocollo di amputazione dell'arto posteriore

1. Induzione
   1. Posizionare il ratto in una camera di induzione di medie dimensioni e indurre l'anestesia con il 2% -4% di isoflurano. Monitorare continuamente il ratto per la profondità dell'anestesia.
      NOTA: La camera di induzione viene scavata in un contenitore di carbone e tutti gli altri gas vengono rimossi da un tavolo a tiraggio basso utilizzato per la chirurgia.
   2. Inserire il naso in un naso. Fissare con nastro adesivo, se necessario.
      NOTA: questa procedura viene eseguita su una tabella di down-draft per eliminare i gas volatili in eccesso (cioè isoflurano).
   3. Rimuovere i peli sulla gamba destra fino all'addome ventrale e dorsale inferiore con tagliacapelli o utilizzare un agente depilatorio. Posizionare il ratto in posizione supina.
   4. Strofinare l'area chirurgica in modo asettico utilizzando etanolo al 70% e diluire clorexidina acetato o betadina diluita. Preparare la pelle per l'intervento chirurgico dal centro del polpaccio all'area della pelle appena sopra l'articolazione dell'anca dell'addome inferiore destro. Strofinare la gamba prossimale e l'area distale circonferenzialmente. Ripetere questo passaggio tre volte.
   5. Applicare il lubrificante per gli occhi in entrambi gli occhi del ratto. Assicurarsi che il ratto abbia una temperatura corporea normale (37 °C) e segni vitali normali. Monitorare e regolare la temperatura corporea utilizzando una piastra riscaldante collegata a un monitor della sonda di temperatura rettale.
2. Chirurgia
   1. Attivare l'isoflurano all'1,5%-3% (manutenzione). Monitorare la profondità anestetica, compresa la reazione al pizzico della punta, la frequenza respiratoria e il carattere. Regolare la velocità di isoflurano secondo necessità per mantenere un piano di anestesia appropriato.
      NOTA: La frequenza respiratoria durante l'anestesia dovrebbe essere compresa tra 50-100 respiri al minuto. Respiri profondi e poco frequenti sono un'indicazione che il ratto è troppo profondamente anestetizzato.
   2. Apri confezioni e tende sterili per strumenti e indossa guanti sterili. Fare attenzione a mantenere la sterilità per tutta la durata della procedura. Gli strumenti chirurgici sterili di base necessari includono, supporto per la lama del bisturi, pinza, emostati, portaago, forbici e applicatore di clip per ferite.
   3. Tirare la gamba del ratto attraverso lo sfiato del drappo chirurgico sterile. Assicurarsi che l'animale si trovi su un piano adeguato di anestesia tramite il riflesso del pizzico della punta.
   4. Usando una lama di bisturi o forbici chirurgiche, fare un'incisione cutanea circonferenziale appena prossimale al soffocamento (articolazione del ginocchio).
   5. Deglove l'arto posteriore usando una garza o una dissezione smussata per esporre l'arteria femorale e la vena sulla superficie ventrale-mediale dell'arto posteriore.
   6. Ligate i vasi usando 4-0 suture assorbibili a livello del femore medio e transetto distalmente.
   7. Blocca la vena distalmente per ridurre le perdite durante la dissezione muscolare.
      NOTA: La muscolatura circonferenziale sarà transettata distale al livello della legatura del vaso dell'arteria femorale e dei muscoli elevati dal femore al livello dell'articolazione coxofemorale.
   8. Usando la dissezione smussata, abdicare l'articolazione dell'anca con rotazione laterale verso l'esterno.
   9. Trova la testa del femore e disarticolatela dall'acetabolo. Tagliare qualsiasi tessuto rimanente mantenendo la gamba attaccata al corpo.
   10. Dare un blocco di spruzzi all'acetabolo e al nervo sciatico con circa 6 mg / kg di Ropivacaina.
   11. Chiudere la muscolatura sopra l'acetabolo usando una semplice sutura interrotta (4-0, sutura riassorbibile).
       NOTA: Ulteriore 0,5% di bupivacaina o lidocaina (0,15-0,2 mg totali) può essere iniettato in diversi siti lungo lo strato muscolare chiuso (infiltrazione locale/blocco schizzi).
   12. Opporsi e chiudere i bordi della pelle utilizzando clip avvolte poste a parte ogni 5-10 mm.
3. Guarigione
   1. Posizionare il ratto in una gabbia di recupero pulita con supporto termico utilizzando una piastra riscaldante posta sotto la gabbia.
      NOTA: Per prevenire l'ipertermia, la piastra riscaldante non deve essere a diretto contatto con l'animale e non deve superare i 40 °C.
   2. Monitorare l'animale fino a quando non si riprende completamente ed è normotermico (37,5-39 °C).
      NOTA: L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando non è completamente cosciente e severamente sdraiato e si muove facilmente intorno alla gabbia.
   3. Dopo essere completamente sveglio, mobile e respirando bene, iniettare ai ratti buprenorfina (1,0-1,2 mg/kg SC).
      NOTA: La somministrazione di buprenorfina in un ratto anestetizzato può compromettere il recupero.
   4. Somministrare 10 mL di soluzione di Ringer lattato a caldo per via sottocutanea tra le scapole.
   5. Sposta i ratti nella gabbia pulita e riunisciti con i conspecifici.
   6. Monitorare tutti gli animali due volte al giorno per il mese successivo per segni di dolore e angoscia, tra cui piloerezione, postura curva o inappetenza o segni di infezione del sito di incisione, tra cui eritema, secrezione purulenta o deiscenza della ferita.
      NOTA: Ad oggi non abbiamo osservato segni clinici (come infezioni) a seguito di recupero post-operatorio in nessuno degli animali. Solo un ratto ha avuto una deiscenza con punti di sutura, dopo di che sono state utilizzate clip per ferite per chiudere le ferite senza ulteriori problemi.
   7. Somministrare buprenorfina o meloxicam ad animali che presentano segni clinici di dolore a dosi pubblicate in consultazione con un veterinario di animali da laboratorio.
   8. Somministrare antibiotici (cioè cefalosporina) ad animali che presentano segni clinici di dolore a dosi pubblicate in consultazione con un veterinario di animali da laboratorio.
      NOTA: Tutti gli animali che mostrano segni prolungati di dolore o angoscia che non migliorano con analgesici o animali che mostrano segni di infezione che non rispondono agli antibiotici devono essere sottoposti a eutanasia umana.

6. Imaging con raggi X

1. Dopo l'impianto del tumore, visualizzare le tibie e i polmoni in modo non invasivo per rilevare la crescita del tumore utilizzando i raggi X con una macchina progettata per i roditori.
2. Anestetizzare i ratti come fatto in precedenza.
3. Scatta immagini con ingrandimento 3x per 6 s a 25 kV.
4. Elaborare la pellicola utilizzando il processore a raggi X. Anche le radiografie possono essere scansionate digitalmente.

7. Procedura di autopsia

1. Eutanasia dei ratti con CO₂. Confermare la morte per mancanza di battito cardiaco e prelevare immediatamente 3 ml di sangue dal cuore per campioni di siero o plasma.
2. Aprire il torace e l'addome per l'esame.
3. Isolare la trachea e cannulare con un catetere (18 G). Per fissare il catetere nella trachea, legare una sutura di seta attorno a entrambe le trachee con il catetere.
4. Collegare il catetere per infusione a una siringa da 3 o 5 ml. Infondere formalina o soluzione salina per gonfiare delicatamente i lobi polmonari per migliori campioni di istologia. Durante l'infusione, i polmoni si gonfiano e consentono una migliore visualizzazione delle metastasi polmonari.
5. Esaminare, sezionare e pesare tutti gli organi toracici e addominali selezionati (come fegato, reni).
6. Fissare gli organi in formalina per istopatologia o congelare su ghiaccio secco, 2-metilbutano o azoto liquido.
7. Per la valutazione dell'espressione proteica utilizzando western blot, fare lisati di tessuti congelati. Gli anticorpi che reagiscono con i tessuti di ratto sono dettagliati¹³.

8. Immunoistochimica

1. Elaborare il tessuto primario del sistema operativo, incorporarlo nella paraffina e sezionarlo per la colorazione immunoistochimica.
2. Recuperare l'antigene dopo la deparaffinazione utilizzando tampone citrato (pH 6,0). Incubare in 0,3% H₂O₂ in metanolo per 30 minuti per estinguere la perossidasi endogena.
3. Bloccare le sezioni di paraffina spesse 5 μm usando siero normale.
4. Incubare con anticorpi primari anti-CD68 e CD3 (vedi tabella) durante la notte a 4 °C.
5. Risciacquare le sezioni in PBS e incubarle in polimero HRP utilizzando un kit di rilevamento.
   NOTA: L'immunocolorazione è stata sviluppata con diaminobenzidina come cromogeno.

9. Western blotting

1. Lisare le cellule UMR-106 in 200-300 μL di tampone di lisi¹⁴ per eseguire l'elettroforesi su gel standard e il western blotting.
2. Utilizzare gel Bis-Tris dal 4% al 12%.
3. Incubare in anticorpi primari anti-ErbB2, anti-ErbB4, anti-EGFR, anti-ERK, β-actina o anti-topo β2-AR (vedi tabella) e anticorpo secondario legato alla perossidasi di rafano.
4. Aggiungere il substrato chemiluminescente. Esporre le membrane alla pellicola a raggi X.
   NOTA: i livelli di β-actina vengono utilizzati come controlli di carico.

Risultati

Per questi studi sul sistema operativo vengono utilizzati ratti immunocompetenti SD di razza SD, che offre un modello animale con un sistema immunitario intatto. Abbiamo utilizzato la linea cellulare UMR106 di ATCC, sviluppata da cellule che erano inizialmente isolate da un sistema operativo da un ratto SD. Abbiamo impiantato le cellule in ratti SD, fornendo così un modello singenico per OS. Le cellule UMR106 vengono impiantate nella tibia di ratti SD maschi e femmine di 3 settimane, simulando un modello di OS pediatric...

Discussione

I ratti con impianti tibiali OS sviluppano tumori misurabili entro 3 settimane dopo l'impianto. Se gli arti con tumori vengono amputati 3 settimane dopo l'impianto, l'incidenza di metastasi polmonari si riduce in modo significativo. I sistemi operativi sono sia osteolitici che osteoblastici. I ratti senza amputazione sviluppano metastasi polmonari multiple e di dimensioni variabili, osservate mediante radiografia o necroscopia entro 7 settimane dall'impianto. EGFR, ErbB2 ed ErbB4 sono espressi in OS UMR106 di ratto, simi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
AKT	Cell Signaling TECHNOLOGY	4685S
absorbable suture	Ethicon	J214H
β-actin	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-47778
β2-AR antibody	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-569	replaced by β2-AR (E-3): sc-271322
Bis–Tris gels	Thermo Fisher	NP0321PK2
Buprenorphine SR Lab	ZooPharm	IZ-70000-201908
CD3 antibody	Dako	#A0452
CD68 antibody	eBioscience	#14-0688-82
Chemiluminescent substrate	cytiva	RPN2232
CL-Xposure film	Thermo Fisher	34089
Complete Anesthesia System	EVETEQUIP	922120
diaminobenzidine	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Doxorubicin	Actavis	NDC 45963-733-60
EGFR antibody	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-03	replaced by EGFR (A-10): sc-373746
ERBB2 antibody	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-284	replaced by Neu (3B5): sc-33684
ERBB4 antibody	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-283	replaced by ErbB4 (C-7): sc-8050
ERK antibody	SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY	sc-514302
eye lubricant	PHARMADERM	NDC 0462-0211-38
Hamilton syringe (100 µL)	Hamilton	Model 1710 SN SYR
horseradish peroxidase-linked secondary antibody	cytiva	NA934
HRP polymer detection kit	VECTOR LABORATORIES	MP-7401
HRP polymer detection kit	VECTOR LABORATORIES	MP-7402
isoflurane	BUTLER SCHEIN	NDC 11695-6776-2
isoflurane vaporizer	EVETEQUIP	911103
UMR-106 cell	ATCC	CRL-1661
X-ray	Faxitron	UltraFocus
X-ray processor	Hope X-Ray Peoducts Inc	MicroMax X-ray Processor	Hope Processors are not available in USA anymore
wound clips	BECTON DICKINSON	427631