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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se presenta un protocolo para extraer el contenido total de lípidos de la pared celular de una amplia gama de micobacterias. Además, se muestran protocolos de extracción y análisis de los diferentes tipos de ácidos micólicos. También se proporciona un protocolo cromatográfico de capa delgada para monitorear estos compuestos micobacterianos.

Resumen

Las especies de micobacterias pueden diferir entre sí en la tasa de crecimiento, la presencia de pigmentación, la morfología de la colonia mostrada en los medios sólidos, así como otras características fenotípicas. Sin embargo, todas tienen en común el carácter más relevante de las micobacterias: su pared celular única y altamente hidrofóbica. Las especies de micobacterias contienen un complejo unido a la membrana covalente que incluye arabinogalactano, peptidoglicano y cadenas largas de ácidos micólicos con tipos que difieren entre las especies de micobacterias. Además, las micobacterias también pueden producir lípidos que se localizan, no unidos covalentemente, en sus superficies celulares, como los dicicocerosatos de fteocerol (PDIM), los glicolípidos fenólicos (PGL), los glicopptidolípidos (GPL), las aciltrehalosas (AT) o los narizidos de fosfatidil-inositol (PIM), entre otros. Algunos de ellos se consideran factores de virulencia en micobacterias patógenas, o lípidos antigénicos críticos en la interacción huésped-micobacterias. Por estas razones, existe un interés significativo en el estudio de los lípidos micobacterianos debido a su aplicación en varios campos, desde la comprensión de su papel en la patogenicidad de las infecciones por micobacterias, hasta una posible implicación como agentes inmunomoduladores para el tratamiento de enfermedades infecciosas y otras patologías como el cáncer. Aquí, se presenta un enfoque simple para extraer y analizar el contenido total de lípidos y la composición de ácido micólico de las células de micobacterias cultivadas en un medio sólido utilizando mezclas de solventes orgánicos. Una vez obtenidos los extractos lipídicos, se realiza cromatografía de capa fina (TLC) para monitorizar los compuestos extraídos. El experimento de ejemplo se realiza con cuatro micobacterias diferentes: mycolicibacterium brumae y Mycolicibacterium fortuitum de rápido crecimiento ambiental, el bacilo atenuado de crecimiento lento Mycobacterium bovis Calmette-Guérin (BCG) y el patógeno oportunista de rápido crecimiento Mycobacterium abscessus, lo que demuestra que los métodos mostrados en el presente protocolo se pueden utilizar para una amplia gama de micobacterias.

Introducción

Mycobacterium es un género que comprende especies patógenas y no patógenas, caracterizadas por tener una pared celular altamente hidrofóbica e impermeable formada por sus peculiares lípidos. Específicamente, la pared celular micobacteriana contiene ácidos micólicos, que son ácidos grasos α-alquilo y β-hidroxi, en los que la rama α es constante en todos los ácidos micólicos (excepto en la longitud) y la cadena β, llamada cadena de meromycolate, es una cadena alifática larga que puede contener diferentes grupos químicos funcionales descritos junto con la literatura (α-, α'-, metoxi-, metoxi-, κ-, epoxi-, carboxi-, y ω-1-metoxi-micolatos), produciendo así siete tipos de ácidos micólicos (I-VII)1. Además, otros lípidos con una importancia incuestionable también están presentes en la pared celular de las especies de micobacterias. Especies patógenas como Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis2 producen factores de virulencia específicos basados en lípidos como dilipocerol dimycocerosatos (PDIMs), glicolípidos fenólicos (PGL), di-, tri-, y penta-aciltrehalosas (DAT, TAT y PAT), o sulfolípidos, entre otros.3. Su presencia en la superficie micobacteriana se ha asociado con la capacidad de modificar la respuesta inmune del huésped y por tanto, la evolución y persistencia de la micobacteria dentro del huésped.4. Por ejemplo, la presencia de triacilgliceroles (TAG) se ha asociado con el fenotipo hipervirulento del linaje 2-Beijing sublinaje de M. tuberculosis, posiblemente debido a su capacidad para atenuar la respuesta inmune del huésped5,6. Otros lípidos relevantes son los lipooligosacáridos (LOS) presentes en micobacterias tuberculosas y no tuberculosas. En el caso de Mycobacterium marinum, la presencia de LOSs en su pared celular está relacionada con la motilidad deslizante y la capacidad de formar biopelículas e interfiere con el reconocimiento por parte de los receptores de reconocimiento de patrones de macrófagos, afectando la absorción y eliminación de las bacterias por los fagocitos del huésped.7,8. Además, la ausencia o presencia de algunos lípidos permite clasificar a los miembros de una misma especie en diferentes morfotipos con perfiles virulentos o atenuantes al interactuar con las células huésped. Por ejemplo, la ausencia de glicopeptidolípidos (GPL) en el morfotipo rugoso de Mycobacterium abscessus se ha asociado con la capacidad de inducir acidificación intrafagosómica y, en consecuencia, apoptosis celular9, a diferencia del morfotipo liso que posee G L GPL en su superficie. Además, el contenido de lípidos de la pared celular micobacteriana está relacionado con la capacidad de modificar la respuesta inmune en el huésped. Esto es relevante en el contexto del uso de algunas micobacterias para desencadenar un perfil inmune protector contra diferentes patologías.10,11,12,13. Se ha demostrado, por ejemplo, que Mycolicibacterium vaccae, una micobacteria saprófita, que actualmente se encuentra en ensayos clínicos de fase III como vacuna inmunoterapéutica para la tuberculosis, muestra dos morfotipos coloniales. Mientras que el fenotipo liso, que contiene un poliéster en su superficie, desencadena una respuesta Th2, el fenotipo rugoso desprovisto del poliéster puede inducir un perfil Th1 cuando interactúa con las células inmunes del huésped.14. El repertorio de lípidos presentes en la célula micobacteriana no solo depende de las especies de micobacterias, sino también de las condiciones de los cultivos de micobacterias: tiempo de incubación.15,16 o composición del medio de cultivo17,18. De hecho, los cambios en la composición del medio de cultivo afectan a la actividad antitumoral e inmunoestimuladora de M. bovis BCG y Mycolicibacterium brumae in vitro17. Además, el perfil inmune protector desencadenado por M. bovis BCG contra M. tuberculosis El desafío en modelos de ratones también depende de los medios de cultivo en los que M. bovis BCG crece17. Estos podrían estar relacionados con la composición lipídica de las micobacterias en cada condición de cultivo. Por todas estas razones, el estudio del contenido lipídico de las micobacterias es relevante. Se presenta un procedimiento visual para extraer y analizar la composición lipídica de la pared celular micobacteriana.

Protocolo

1. Extracción del total de lípidos no ligados a covalentes de micobacterias (Figura 1)

  1. Rasque 0,2 g de micobacterias de un medio sólido y agréguelo a un tubo de vidrio con un tapón de rosca de revestimiento de politetrafluoroetileno (PTFE). Añadir una solución compuesta por 5 ml de cloroformo y 10 ml de metanol (cloroformo:metanol, 1:2).
    NOTA: Cuando se utilizan disolventes orgánicos, solo se debe usar un recipiente de vidrio. No se permiten envases de plástico. Además, se necesitan tapones de rosca de revestimiento de PTFE para botellas.
    PRECAUCIÓN: El cloroformo es una sustancia potencialmente tóxica y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
    PRECAUCIÓN: El metanol es una sustancia potencialmente tóxica y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
  2. Deje el tubo en agitación constante durante la noche para extraer lípidos no ligados a covalentes de la superficie celular micobacteriana.
    NOTA: Si una plataforma de agitación orbital no está disponible, la agitación constante se puede reemplazar por agitación manual periódica con la mayor frecuencia posible.
  3. Cubra un embudo de vidrio con un papel de filtro, filtre los disolventes orgánicos y recójalos en un tubo de vidrio.
  4. Use un flujo de gas nitrógeno para evaporar la fase líquida en el tubo. Llene el tubo con gas nitrógeno, cúbralo y guárdelo a 4 °C.
    NOTA: Conecte una pipeta Pasteur de vidrio a la corriente de gas nitrógeno para evaporar específicamente el tubo deseado. Además, mantenga el tubo dentro de un calentador de bloque seco para tubos a 37 °C. Cuando el disolvente se evapore, llene el tubo con gas nitrógeno antes de cerrarlo.
  5. Añadir 15 ml de una solución de cloroformo:metanol (2:1) a los desechos celulares. Deje el tubo en agitación constante durante la noche para extraer lípidos no ligados a covalentes de la superficie celular micobacteriana.
    NOTA: Si una plataforma de agitación orbital no está disponible, la agitación constante se puede reemplazar por agitación manual periódica con la mayor frecuencia posible.
  6. Deja reposar la mezcla durante 1 h. Con una pipeta Pasteur, recupera los disolventes orgánicos. Cubra un embudo de vidrio con un papel de filtro y filtre los disolventes orgánicos y recójalos en el mismo tubo de vidrio utilizado anteriormente en el paso 1.3. Use un flujo de gas nitrógeno para evaporar la fase líquida en el tubo. Llene el tubo con gas nitrógeno, ciérdelo y guárdelo de nuevo a 4 °C.

2. Extracción de ácido micólico por metanolisis ácida (Figura 2A)

  1. Agregue 2-5 ml de solución esterificante en un tubo de vidrio hermético con una tapa de rosca de revestimiento de PTFE. Agregue 0,2 g de biomasa de micobacterias en el tubo de vidrio.
    NOTA: La solución esterificante se forma mezclando 30 ml de metanol, 15 ml de tolueno y 1 ml de ácido sulfúrico. Las células de micobacterias se pueden tomar de cultivos sólidos o, incluso, de células deslipidas después de realizar la extracción de lípidos totales no ligados a covalentes de micobacterias (células restantes después del filtrado en el paso 1.6).
    PRECAUCIÓN: El tolueno es una sustancia inflamable y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
    PRECAUCIÓN: El ácido sulfúrico es una sustancia corrosiva y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
  2. Mezclar el contenido mediante vórtice. Deje reposar la mezcla dentro de un baño seco a 80 °C durante la noche.
  3. Deje que el tubo se enfríe hasta que alcance la temperatura ambiente y luego agregue 2 ml de n-hexano al tubo. Mezclar el contenido mediante vórtice durante 30 s y dejar que el tubo se asiente hasta que aparezcan dos fases claras.
    PRECAUCIÓN: El n-hexano es una sustancia potencialmente inflamable, irritante, perjudicial para el medio ambiente y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
  4. Recuperar la fase superior correspondiente a la fase n-hexano. Transfiéralo a un tubo nuevo.
  5. Repita el paso 2.3. Recupere la fase superior de nuevo y transfiérala al mismo tubo utilizado en el paso 2.4.
  6. Evaporar el contenido del tubo utilizando un flujo de gas nitrógeno. Llene el tubo con gas nitrógeno, ciérdelo y guárdelo a 4 °C.

3. Extracción de ácido micólico por saponificación y metilación (Figura 2B)

  1. Rasca 0,2 g de micobacterias de un medio sólido y añádelo a un tubo de vidrio con un tapón de rosca de PTFE.
  2. Añadir 2 ml de solución de metanol-benceno (80:20) que contenga hidróxido de potasio al 5%. Mezclar el contenido mediante vórtice. Calentar la mezcla durante 3 h a 100 °C.
    PRECAUCIÓN: El benceno es una sustancia inflamable, cancerígena y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
  3. Deje que el tubo se enfríe a temperatura ambiente. Añadir un 20% de ácido sulfúrico para acidificar las muestras y lograr un pH = 1.
  4. Añadir 3 ml de éter dietílico. Mezcle suavemente el contenido mediante vórtice.
  5. Deje que las dos fases se formen asentándose. Recuperar la fase de éter dietílico y transferir a un nuevo tubo. Repita el paso de lavado por un total de tres veces.
  6. Lave el extracto de éter dietílico con 2 ml de agua destilada y transfiera la parte superior correspondiente al éter dietílico a un nuevo tubo. Repita el paso de lavado por un total de tres veces.
  7. Agregue 2 g de sulfato de sodio anhidro sobre el extracto de éter dietílico para secarlo.
  8. Filtra la suspensión. Evaporar el contenido utilizando un flujo de gas nitrógeno.
  9. Para realizar la etapa de metilación, disolver 3 g de N-nitroso-N-metil urea en una solución preenfriada formada por 45 mL de éter dietílico y 9 mL de KOH al 40% en agua destilada.
    PRECAUCIÓN: La N-nitroso-N-metilurea es una sustancia tóxica, irritante, cancerígena y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
  10. Transfiera el sobrenadante (diazometano) a un nuevo matraz enfriado en hielo que contenga gránulos de hidróxido de potasio (aproximadamente 30 g).
    NOTA: Si el sobrenadante no se utiliza inmediatamente, se puede almacenar a -20 °C durante un máximo de 1 h.
    PRECAUCIÓN: Los gránulos de hidróxido de potasio son una sustancia irritante y corrosiva. Este material debe utilizarse en una campana de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (capa de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
    PRECAUCIÓN: El diazometano es altamente tóxico y potencialmente explosivo. Debe usarse en una campana de flujo laminar con vidrio de seguridad que use el equipo de protección personal apropiado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
  11. Añadir 2 ml de la solución de éter que contiene diazometano, obtenida en el paso 3.10, en el extracto de éter dietílico seco que contiene ácidos micólicos, obtenido en el paso 3.8. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
  12. Evaporar la suspensión a 40 °C. Llene el tubo con gas nitrógeno, ciérdelo y almacene los lípidos metilados a 4 °C.
    NOTA: Evapore el diazometano de la solución de éter debajo de la campana de flujo laminar, hasta que el éter pierda el color amarillo.

4. Análisis de cromatografía en capa fina (TLC)

  1. Saturar la cámara TLC de vidrio. Para ello, cubra una de las paredes de la cámara TLC con un trozo de papel de filtro y deje que esté en contacto con la fase móvil compuesta por la mezcla de disolventes. Coloque el volumen restante del disolvente en la parte inferior de la cámara TLC.
    NOTA: La parte inferior de la cámara TLC debe estar cubierta por al menos 1 cm de la fase móvil. En los presentes experimentos, se utilizaron diferentes fases móviles para desarrollar los TMIC. Consistieron en 85 ml de n-hexano más 15 ml de éter dietílico; 100 ml de diclorometano; 90 ml de cloroformo, 10 ml de metanol y 1 ml de agua; 30 ml de cloroformo, más 8 ml de metanol y 1 ml de agua; 60 ml de cloroformo, más 35 ml de metanol y 8 ml de agua; 95 ml de cloroformo más 5 ml de metanol; y 90 ml de éter de petróleo (60-80 °C) más 10 ml de éter dietílico.
    NOTA: En el TLC bidimensional, use n-hexano:acetona (95:5) en la primera dirección tres veces, y use un solo desarrollo con tolueno:acetona (97:3) en la segunda dirección para analizar la composición del ácido micólico. Para analizar los PPY, use cloroformo: metanol: agua (60: 30: 6) en la primera dirección una vez, y use cloroformo: ácido acético: metanol: agua (40: 25: 3: 6) en la segunda dirección. Para analizar PDIM y AG, use éter de petróleo (60-80 ° C): acetato de etilo (98: 2) en la primera dirección tres veces, y use un solo desarrollo con éter de petróleo (60-80 ° C): acetona (98: 2) en la segunda dirección.
    PRECAUCIÓN: El éter dietílico es una sustancia potencialmente tóxica y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
    PRECAUCIÓN: El diclorometano es una sustancia potencialmente tóxica y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
    PRECAUCIÓN: El éter de petróleo es una sustancia potencialmente inflamable, perjudicial para el medio ambiente y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
    PRECAUCIÓN: El ácido acético es una sustancia potencialmente inflamable y corrosiva. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
    PRECAUCIÓN: El acetato de etilo es una sustancia inflamable y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
    PRECAUCIÓN: La acetona es una sustancia inflamable y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
  2. Cierre la cámara TLC para saturarla durante al menos 20 min. Mientras tanto, disuelva los lípidos presentes en el tubo de vidrio en 0.2-1 ml de cloroformo.
    NOTA: El volumen utilizado para disolver los lípidos puede modificarse dependiendo de la concentración deseada o esperada de la muestra.
  3. Aplique 10 μL de cada suspensión utilizando un tubo de vidrio capilar directamente sobre la placa TLC y deje secar la muestra durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    NOTA: Las muestras deben aplicarse en la parte inferior de la placa dejando 1 cm a cada lado. Las muestras deben separarse unas de otras durante al menos 0,5 cm. Una vez que la muestra se aplica en la placa, los tubos se pueden evaporar nuevamente con gas nitrógeno y almacenarse a 4 ° C para su uso posterior.
  4. Inserte la placa en la cámara TLC saturada que contiene la fase móvil. Permita que la fase móvil se ejecute a través del TLC.
    NOTA: Cualquier movimiento aplicado a la cámara TLC afecta al disolvente en funcionamiento en la placa y afecta la movilidad de los lípidos. En el caso de realizar TLC bidimensional, se requieren dos cámaras TLC para contener ambos sistemas de elución.
  5. Retire la placa de la cámara TLC cuando el disolvente alcance 1 cm de distancia del extremo superior de la placa. Deje la placa bajo flujo laminar hasta que la sílice esté totalmente seca.
    NOTA: En el caso de analizar la composición del ácido micólico, utilizando n-hexano y dietil-éter (85:15), repita los pasos 4.4 y 4.5 dos veces más, hasta ejecutar la fase móvil tres veces sobre la placa TLC.
  6. Revelar la placa con la mancha requerida; calentar la placa si es necesario.
    NOTA: En el presente experimento, se utilizaron 15-20 ml de las siguientes soluciones para rociar las placas TLC: 10% de ácido molibdatofosfórico hidratado en etanol hasta que la placa sea de color amarillo brillante, seguido de calentar la placa a 120 ° C; 5% en etanol de 20% α-naftol en ácido sulfúrico seguido de calentar la placa a 120 °C; Reactivo de molibdeno azul (1,3% de óxido de molibdeno en ácido sulfúrico de 4,2 M) hasta que aparecieron bandas de fosfato o antrono al 1% en ácido sulfúrico.
    PRECAUCIÓN: El hidrato de ácido molibdatofosfórico es una sustancia inflamable y corrosiva. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
    PRECAUCIÓN: El etanol es una sustancia potencialmente inflamable y peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
    PRECAUCIÓN: El 1-naftol es una sustancia inflamable, corrosiva y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).
    PRECAUCIÓN: El reactivo de pulverización azul de molibdeno es una sustancia corrosiva, tóxica y extremadamente peligrosa. Debe usarse en una capucha de flujo laminar con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes de nitrilo).

Resultados

Con el objetivo de mostrar una amplia gama de lípidos presentes en diferentes especies de micobacterias, se seleccionó M. bovis BCG por tratarse de micobacterias rugosas y de crecimiento lento. En el procedimiento se añadieron M. fortuitum y M. brumae rugosas y de rápido crecimiento y, finalmente, también se incluyó el morfotipo liso de M. abscessus. Estas cuatro especies nos permiten visualizar un amplio espectro de lípidos derivados de micobacterias como aciltrehalosas (AT), ...

Discusión

Se presenta un protocolo simple considerado como el método estándar de oro para la extracción de compuestos lipídicos no unidos covalentemente de la pared celular micobacteriana. Se muestra una visualización adicional por TMIC unidimensionales y bidimensionales de los lípidos extraídos de cuatro micobacterias diferentes.

Dos mezclas combinadas consecutivas de cloroformo y metanol para recuperar el contenido lipídico de las células micobacterianas es la mezcla de disolventes más utili...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (RTI2018-098777-B-I00), los Fondos FEDER y la Generalitat de Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido es beneficiaria de un contrato de doctorado (FI) de la Generalitat de Catalunya.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic AcidMerck100063CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur
AcetoneCarlo Erba400971NCAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000
AnthroneMerck8014610010Anthrone for synthesis.
BenzeneCarlo Erba426113CAUTION. Benzene RPE - For analysis - ACS 2.5 l
Capillary glass tubeMerckBR708709BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark
ChloroformCarlo Erba412653CAUTION. Chloroform RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with ethanol 2.5 L
Dry block heaterJ.P. Selecta7471200
DicloromethaneCarlo Erba412622CAUTION. Dichloromethane RS - For HPLC - Isocratic grade - Stabilized with amylene 2.5 L
Diethyl etherCarlo Erba412672CAUTION. Diethyl ether RS - For HPLC - Isocratic grade - Not stabilized 2.5 L
Ethyl AcetatePanreac1313181211CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO
Ethyl Alcohol AbsoluteCarlo Erba4146072CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE - For analysis - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L
Glass funnelVidraFOCDURA.2133148 1217/1
Glass tubeVidraFOCVFOC.45066A-16125Glass tube with PTFE recovered cap
MethanolCarlo Erba412722CAUTION. Methanol RS - For HPLC - GOLD - Ultragradient grade 2.5 L
Molybdatophosphoric acid hydrateMerck51429-74-4CAUTION.
Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3%SigmaM1942-100MLCAUTION.
n-hexaneCarlo Erba446903CAUTION. n-Hexane 99% RS - ATRASOL - For traces analysis 2.5 L
n-nitroso-n-methylureaSigmaN4766CAUTION
Orbital shaking platformDDBiolab995018NB-205L benchtop shaking incubator
Petroleum ether (60-80ºC)Carlo Erba427003CAUTION. Petroleum ether 60 - 80°C RPE - For analysis 2.5 L
SprayerVidraFOC712/1
Sodium sulphate anhydrousMerck238597
Sulfuric acid 95-97%Merck1007311000CAUTION. Sulfuric acid 95-97%
TLC chamberMerckZ204226-1EARectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm
TLC plateMerck1057210001TLC SilicaGel 60- 20x20 cm x 25 u
TLC Plate HeaterCAMAG223306CAMAG TLC Plat Heater III
TolueneCarlo Erba488551CAUTION. Toluene RPE - For analysis - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L
VortexFisher Scientific10132562IKA Agitador IKA vórtex 3
1-naphtholSigma-Aldrich102269427CAUTION.

Referencias

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