Модификации метода Лангендорфа для одновременного выделения предсердных и желудочковых миоцитов у взрослых мышей

Резюме

Этот протокол описывает модификации метода Лангендорфа, включая глубину канюляции аорты для одновременного выделения предсердных и желудочковых миоцитов у взрослых мышей.

Аннотация

Единый кардиомиоцит является жизненно важным инструментом в исследованиях клеточного и субклеточного уровня сердечной биологии и заболеваний как фундаментальной единицы сокращения и электрической активности. Следовательно, выделение жизнеспособных, высококачественных кардиомиоцитов из сердца является начальным и наиболее важным экспериментальным шагом. Сравнивая различные протоколы выделения кардиомиоцитов взрослых мышей, ретроградная перфузия Лангендорфа является наиболее успешным и воспроизводимым методом, о котором сообщалось в литературе, особенно для выделения желудочковых миоцитов. Тем не менее, выделение качественных предсердных миоцитов из перфузированного сердца остается сложной задачей, и имеется мало успешных отчетов об изоляции. Решение этой сложной проблемы чрезвычайно важно, потому что, помимо желудочковых заболеваний, предсердия составляют большую часть сердечных заболеваний. Поэтому необходимы дальнейшие исследования на клеточном уровне для выявления механизмов. В этой работе введен протокол, основанный на методе ретроградной перфузии Лангендорфа, и одновременно сделаны некоторые модификации глубины канюляции аорты и этапов, которые могут повлиять на процесс пищеварения для выделения предсердных и желудочковых миоцитов. Кроме того, подтверждено, что изолированные кардиомиоциты поддаются исследованию зажимов.

Введение

Сердечные заболевания являются одной из ведущих глобальных причин ^{смертности1}. Чтобы справиться с этим бременем на систему здравоохранения, необходимо глубокое понимание физиологии и патологии сердца. Помимо подготовки целого животного и интактного сердца, клеточный препарат является еще одним незаменимым средством для функционального исследования и исследования ^{заболеваний2}. Применяя зажим пластыря, визуализацию кальция, молекулярную биологию и другие передовые технологии, исследователи могут получить больше информации об электрофизиологических свойствах, гомеостазе кальция, сигнальных путях, метаболических состояниях и транскрипциях генов в одном кардиомиоците (CM). Это чрезвычайно полезно для выявления физиологических и патологических механизмов процесса сердечных заболеваний3,4,5,6,7. Для исследований на животных могут использоваться виды, начиная от мелких (например, мыши, крысы и морские свинки) до крупных (например, кролики и собаки) животных. Обычно предпочтение отдается мелким животным, особенно мышам, поскольку они поддаются генетическим манипуляциям и манипуляциям с моделями заболеваний8,9,10.

Методы остро изолированных КМ претерпели длительный период развития и продолжают ^{развиваться11}. Ретроградная перфузия Лангендорфа является наиболее успешным и воспроизводимым методом выделения КМ, применяемым у крыс и мышей, особенно для выделения желудочковых миоцитов (ВМ)12,13,14,15. Однако сообщения об успешно изолированных предсердных миоцитах (АМ) скудны16,17,18. Дальнейшие исследования на обоих уровнях всего органа / системы и клеточного / субклеточного для выявления механизмов и изучения новых терапевтических подходов оправданы, поскольку фибрилляция предсердий (ФП), наиболее распространенный тип аритмии, становится все более распространенным во всем мире, и современные методы лечения как в фармакологической терапии, так и в сердечной абляции остаются неэффективными примерно у 40%-50% пациентов с ^ФП19 . Успешная изоляция СМ у взрослых мышей является первым шагом к клеточному исследованию. Можно использовать два основных метода изоляции: метод chunk и метод Langendorff. В методе перфузии Лангендорфа переваривание тканей зависит от раствора фермента, доставляемого коронарными артериями и их ветвями в капиллярные русла. Правильная глубина канюляции аорты, которая может избежать проникновения в аортальные клапаны и блокирования остии коронарной артерии, является необходимым условием для достижения такой картины перфузии, что также является важным шагом для эффективного пищеварения и идеального выхода VM. Следовательно, разумно предположить, что глубина канюляции аорты может аналогичным образом влиять на перфузию сосуда предсердий и, наконец, влиять на выход АМ. Чтобы проверить эту гипотезу, была выполнена канюляция аорты на разных глубинах и сравнивались соответствующие выходы AM. Данные показали, что глубина канюляции аорты имеет непосредственное отношение к выходу АМ. Здесь вводится протокол для одновременной изоляции АМ и виртуальных машин.

протокол

Взрослые самцы мышей C57BL/6 весом 20-30 г в возрасте 8-10 недель были приобретены в Центре животных Столичного медицинского университета, Пекин, Китай. Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Столичного медицинского университета и были выполнены в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, предложенным Институтом ресурсов животных и опубликованным Национальными институтами здравоохранения. Для сбора и анализа данных использовались Excel и Origin 8.5. Данные представлены в виде средств ± SD, для статистической оценки использовался тест Student's t и P < 0,05 считался статистически значимым.

1. Приготовление раствора и перфузионного аппарата

1. Соберите аппарат Лангендорфа с постоянным потоком (коммерчески доступный или самодельный). На рисунке 1 показана простая схема.
2. Готовят растворы в соответствии с реагентами, приведенными в таблице 1 и таблице 2.
3. Включите циркуляционную водяную баню и отрегулируйте подходящую входную температуру (42,7 °C в нашей лаборатории), чтобы гарантировать, что отток системы циркуляции перфусата из канюли достигнет 37 °C.
4. Очистите перфузионную систему путем циркуляции деионизированной воды. Если требуется стерильное состояние, пропустите 75% этанола через перфузионную систему в течение 15 минут, а затем деионизированную воду (не менее 10 циклов, чтобы избежать воздействия токсичности алкоголя на сердце).
5. Измерьте время и объем для одного цикла системы циркуляции перфусата, чтобы определить, сколько миллилитров насыщенного кислородом раствора Тирода должно быть загружено на следующей стадии перфузии.
6. Стерилизуйте все хирургические инструменты нужным методом.
7. Установите скорость потока перфузионной системы перфусата на уровне 4 мл/мин.
8. Приготовьте две чистые 35-миллиметровые чашки Петри – одну, содержащую раствор Тирода (чашка Петри 1), другую , содержащую раствор 1 (чашка Петри 2).
9. Приготовьте шприц объемом 1 мл, наполненный раствором 1 и иглой канюли из тупой стали 20 г с насечкой, откуда расстояние до кончика составляет 1 мм. Подготовьте рыхлый узел с 3-0 швом к стержню канюли. Отрегулируйте поле обзора стереомикроскопа и убедитесь, что наконечник канюли находится ниже жидкой поверхности чашки Петри 2.

2. Подготовка животных

1. Вводят гепарин (концентрация, 1000 МЕ/мл; 0,2 мл/мышь) внутрибрюшинно мышам, чтобы избежать образования тромбов. Через 10 мин обезболивают мышей пентобарбиталом натрия (50 мг/кг, инъекция I.P.) и убедитесь, что мыши перестают реагировать на щепотки хвоста/пальца ноги. Выполняют вывих шейки матки через 20 мин после введения гепарина.
2. Перенесите мышей на хирургическую платформу, зафиксируйте мышей в положении лежа на спине, стерилизуйте грудную клетку 75% этанолом и высушите ее марлей или салфеткой.

3. Иссечение сердца и канюляция аорты

1. Поднимите кожу меченосца тканевыми щипцами и сделайте незначительный боковой разрез через кожу тканевыми ножницами. Выполните тупое рассечение между кожей и фасцией и вытяните разрез кожи в V-образной форме по направлению к впадинам с обеих сторон.
   1. Продолжайте тот же след разреза через грудную клетку, а затем отклоните грудную клетку вверх, зажав грудину тканевыми щипцами, чтобы полностью обнажить сердце и легкие.
2. Очистите перикард с помощью изогнутых щипцов. Разорвите вилочковую железу в обе стороны двумя изогнутыми щипцами, если она покрывает большие сосуды. Осторожно потяните основание сердца к хвосту изогнутыми щипцами, пока не будет виден «Y»-образный кровеносный сосуд (аорта и ее ветвистые артерии).
3. Чтобы зарезервировать различную длину аорты для канюляции и сравнения, трансецируйте аорту в левой общей сонной артерии (зеленая линия на рисунке 2) и одновременно перерезайте брахиоцефальную артерию у некоторых мышей. Трансекция на восходящую аорту у других мышей (черная линия на рисунке 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для тех, кто новичок в этой процедуре, этот шаг также может быть выполнен под стереоскопическим микроскопом.
4. Иссекните сердце, и немедленно погрузите в чашку Петри 1 для промывания и откачки остаточной крови.
5. Перенесите сердце в чашку Петри 2 и обрежьте все излишки ткани с помощью тонких ножниц для радужной оболочки, если это необходимо. Для тех, кто новичок в этой процедуре, сделайте этот шаг под стереомикроскопом, чтобы избежать ошибочного разрезания аорты или других структур сердца.
6. Надавите на шприц, чтобы изгнать пузырьки воздуха перед канюляцией аорты. Выполняют ретроградную канюляцию аорты с помощью двух прямых щипцов (гладких челюстей) под стереомикроскопом. Убедитесь, что весь процесс канюляции находится под поверхностью жидкости.
7. Избегайте проникновения в аортальные клапаны и регулируйте глубину до восходящей аорты (мышь о том, что аорта была трансецирована в левую общую сонную артерию) и корень аорты (у мыши, что аорта была трансецирована на восходящей аорте) соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина канюляции аорты (называемая просто глубиной) определяется здесь как положение, когда кончик канюли находится в аорте или где аорта перевязана.
8. Обжигайте аорту предварительным узлом 3-0 швом к выемке канюли. Осторожно надавите на содержимое шприца, чтобы промыть остаточную кровь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь покинет коронарные артерии и вытечет из дорсальных вен, если глубина правильно расположена. Сердце и предсердные придатки расширятся и станут бледными.
9. Снимите и подключите канюлю к аппарату Лангендорфа. Еще раз, позаботьтесь о том, чтобы избежать пузырьков воздуха, попадающих в сердце.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что время от торакотомии до начальной перфузии не должно превышать 5 мин.

4. Перфузия сердца

1. Сначала прайм и перфузируйте насыщенный кислородом раствор Тирода в течение примерно 10 с (объем жидкости, работающей 10 с в системе, используемой в этом протоколе, составляет примерно 0,7 мл), если в предсердиях есть остаточная кровь, а затем переключают на раствор 1. Однако просто перфузируйте раствором 1, если в предсердиях нет остаточной крови. Перфузируйте сердце в течение примерно 2 мин.
2. Переключитесь на решение 3. Всасывайте около 2,5 мл раствора 3 одноразовым стерильным полиэтиленовым пипетом и предварительно согревайте его на водяной бане для последующего использования, а остальное используют для перфузии примерно 11-12 мин. Откажитесь от раствора по 3 перфузии в первые 2 мин. Переработайте остальное в резервуары перфузата перистальтическим насосом для повторного использования до завершения пищеварения.
3. Прекращают пищеварение, когда сердце становится опухшим и становится слегка бледным и вялым (губчатая текстура) или отпечаток существует, если миокард мягко защемляется зубчатыми щипцами.

5. Выделение клеток и реинтродукция кальция

1. Удалите желудочки и предсердия щипцами и поместите их в разные чашки Петри. Добавьте предварительно приготовленный раствор 3 в чашки Петри.
2. Тритурируйте ткань в мутную текстуру тупыми щипцами и аккуратно пипсируйте ткань для равномерного пищеварения. Избегайте введения пузырьков воздуха.
3. Переложите мутную переваренную ткань с пипеткой в раствор 4, чтобы остановить оставшуюся активность фермента, а затем центрифугу в течение 20 с при 192×г. Удалите надосадочный материал и добавьте раствор 5 в клеточный осадок и пипетку, чтобы равномерно диспергировать клетки.
4. Повторно вводите кальций поэтапно, чтобы избежать парадокса кальция и перегрузки кальцием. Постепенно добавляют в общей сложности 50 мкл 100 мМ/л _CaCl2 (с интервалом в 5 мин 5 мкл, 10 мкл, 15 мкл и 20 мкл соответственно) в клеточную суспензию.

6. Хранение ячеек

1. Для исследования зажима пластыря храните ячейки в растворе Тирода. Для других клеточных исследований храните клетки в растворе 6.
2. Чтобы обеспечить точность результатов острых функциональных исследований (например, искры ^Ca2+ , волны ^Ca2+ , высвобождение ^Ca2+ , утечка ^Ca2+ и записи зажимов патча), завершите эти виды функциональных экспериментов в течение следующих 6 ч.

Результаты

Эта статья, где кончик канюли расположен в аорте, которая определяется как глубина канюляции аорты (называемая просто глубиной), также представляет, где аорта перевязана. AM и VM, выделенные из сердца, которое было каннулировано и перевязано на восходящей аорте, представлены как AMAA и VMAA соответственно. Кроме того, AM и VM, выделенные из сердца, которое было каннулировано и перевязано в корне аорты, представлены как AMAR и VMAR соответственно. На рисунке 2 показан обзор положений аорты и трансекции. Кроме того, на рисунке 3 показаны глубины и места перевязки, которые соответствуют положениям трансекции аорты. Глубина была связана с перфузией предсердий и предсердных придатков. Оба предсердных придатка раздуваются, когда кончик канюли находится на восходящей аорте, что указывает на достаточную перфузию предсердий. Однако, когда в корне аорты перфузия предсердий недостаточна, и оба предсердных придатка раздуваются (рисунок 4). Морфология и жизнеспособность КМ, которые выделяются из канюлированных сердец на разной глубине после реинтродукции кальция (рисунок 5). Клеточные морфологии AMAA, AMAR, VMAA и VMAR находятся под конфокальным микроскопом до и после реинтродукции кальция. AM имеют веретенообразную форму, тогда как виртуальные машины имеют стержневую форму с прямоугольными концами. Кроме того, АМ и ВМ имеют неповрежденные мембраны, четкие контуры, прозрачные полосатые саркомеры и гладкие поверхности (рисунок 6). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью окрашивания в синий цвет трипана. Нормальные клетки с интактными мембранами могут исключать трипан синий и не окрашиваться, тогда как активность потери клеток внутриклеточных клеток будет быстро накапливать трипан синий (рисунок 7). AMs и виртуальные машины были размещены на разных слайдах объектов для выполнения подсчета ячеек. Общий выход АМ и процент жизнеспособных веретенообразных КМ (выживаемость) определяли путем переноса 10 мкл клеточной суспензии на предметный слайд и подсчитывали под перевернутым фазоконтрастным микроскопом при 4 × 10 полях зрения. Этот же метод использовался для определения общей доходности виртуальных машин (в форме стержней) и процента жизнеспособных виртуальных машин. Этот метод предпочтительнее использования гемоцитометра, потому что КМ не легко распределяются в счетной области гемоцитометра из-за их размера и формы. Гистограмма (рисунок 8) показывает показатели выживаемости AMAA, AMAR, VMAA и VMAR до и после реинтродукции кальция. Каждое значение представляет собой среднее ± SD от 10 мышей. До реинтродукции кальция показатели выживаемости АМАА значительно выше, чем у АМАР (70,9% ± 2,8% и 41,0% ± 5,2% соответственно; p < 0,01). После реинтродукции кальция выживаемость АМАА значительно выше, чем у АМАРА (69,4% ± 3,0% и 37,7% ± 4,9% соответственно; p < 0,01).

Показатели выживаемости VMAA не отличались от показателей VMAR (89,5% ± 2,7% против 88,1% ± 2,6% соответственно; p > 0,05) перед повторным введением кальция. Аналогичным образом, показатели выживаемости VMAA не отличались от показателей VMAR (82,2% ± 1,9% против 82,9% ± 1,6% соответственно; p > 0,05) после реинтродукции кальция.

Сердце, канюлированное на глубине, как рекомендовано этим протоколом (на восходящей аорте), жизнеспособный выход VM и AM составляет примерно 4,1 миллиона и примерно 180 000, соответственно, после реинтродукции кальция. Запись натриевого тока (рис. 9А, В) и плотностей тока (рисунок 9С) в изолированных АМ и ВМ подтверждает, что качество клеток соответствовало требованиям электрофизиологических экспериментов. Анатомия аорты (рисунок 10) показывает, что остий предсердного сосуда находится вблизи корня аорты и примыкает к остию коронарной артерии (СА). В таблице 3 показано расстояние от кончика канюли до остиума СА червей, каннулированных и перевязанных на восходящую аорту и корень аорты соответственно.

Рисунок 1. Принципиальная схема собранной модифицированной системы Лангендорфа. Эта система экономична и портативна для пользователей. Он имеет две части пластиковой трубки - одну для воды (внутренний диаметр, 8 мм) и одну для перфузата (внутренний диаметр, 1,5 мм), из которых дистальный конец соединен с полиэтиленовым медицинским трехходовым запорным краном с замком Luer. Стеклянная бутылка, содержащая воду и с резиновой пробкой, образует теплообменник. Перфусат закачивается в пластиковую трубку в теплообменнике перистальтическим насосом и выходит из трехходового запорного крана, соединенного с канюлей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Аорта и ткани вокруг. «Y»-образной структурой кровеносного сосуда является аорта и ее ветви: брахиоцефальная артерия (стрелка 1) и левая общая сонная артерия (стрелка 2). Трансецировать аорту между левой общей сонной артерией (зеленая линия) и одновременно перерезать брахиоцефальную артерию у некоторых мышей; трансецируют на восходящую аорту (черную линию) у других мышей (стереомикроскоп 10 × 2 увеличения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Фронтальный вид на канюлированное сердце. Черная изогнутая линия представляет собой резцевый край аорты, которая была пересечена между левой общей сонной артерией. Красная изогнутая линия представляет собой резцовый край аорты, трансецированной на восходящей аорте. Прямая линия показывает, где была перевязана аорта: черная у восходящей аорты и красная у корня аорты (стереомикроскоп 10 × 2 увеличения). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4. Перфузионное состояние канюлированных сердец. Предсердия достаточно перфузированы, и оба предсердных придатка раздуваются в сердце (А), канюлируются и перевязываются на восходящей аорте. Тем не менее, оба предсердных придатка в сердце (B) канюлируются и перевязываются на корень аорты, что указывает на плохую перфузию предсердий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5. Оценка морфологии и жизнеспособности клеток после реинтродукции кальция. АМ (А) и ВМ (В), выделенные из сердца, каннулированные и перевязанные на восходящей аорте, представлены как АМАА и ВМАА соответственно. AMs (C) и VM (D), выделенные из сердца, канюлированные и лигированные в корне аорты, представлены как AMAR и VMAR соответственно. Высококачественные СМ покоятся и имеют неповрежденные мембраны, четкие контуры, прозрачные полосатые саркомеры и гладкую клеточную поверхность. AM имеют форму шпинделя, тогда как виртуальные машины имеют стержневую или кирпичную форму с прямоугольными концами. КМ, которые спонтанно сжимаются или содержат пузырьки в мембране, имеют низкое качество, а те, которые сжимаются в сферическую форму, являются мертвыми клетками. Случайное поле зрения (флуоресцентный микроскоп, 10 × 10 увеличений; шкала, 100 мкм). AM = предсердный миоцит, VM = желудочковый миоцит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6. Морфология клеток под конфокальным микроскопом до и после реинтродукции кальция. До реинтродукции кальция AMAA (A) и AMAR (C) имеют веретенообразную форму с четкими контурами, полосатыми саркомерами и гладкими мембранными поверхностями. После реинтродукции кальция AMAA (B) и AMAR (D) также имеют веретенообразную форму с четкими контурами, полосатыми саркомерами и гладкими мембранными поверхностями. До реинтродукции кальция VMAA (E) и VMAR (G) имеют стержневую или кирпичную форму с четкими контурами, полосатые саркомеры и гладкие мембранные поверхности с прямоугольными концами. После реинтродукции кальция VMAA (F) и VMAR (H) также имеют стержневую или кирпичную форму с четкими контурами, полосатыми саркомерами и гладкими мембранными поверхностями с прямоугольными концами (масло конфокального микроскопа, 63 × 10 увеличений; шкала, 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7. Оценка жизнеспособности клеток. Поврежденные клетки, которые теряют активность, окрашиваются трипан-синим цветом. Напротив, жизнеспособные клетки не могут быть окрашены трипановым синим цветом (флуоресцентный микроскоп, 4 × 10 увеличений; шкала, 100 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8. Гистограмма, показывающая показатели выживаемости AMAA, AMAR, VMAA и VMAR до и после реинтродукции кальция. CR = реинтродукция кальция. Каждое значение представляет собой среднее ± SD от 10 мышей. p < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Решение	Содержание (конечная концентрация в ммоль/л, если не указано иначе)	знаменитый
Перфузионный раствор (раствор 1)	113 NaCl, 4.7 KCl, 0.6 KH2PO4, 0.6 Na2HPO4, 1.2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Таурин, 5 Глюкоза, 10 2,3-бутандион моноксим (BDM)	Который можно хранить в течение 3 дней при 4 °C. Глюкоза, таурин и БДМ добавляются в день эксперимента. Приготовьте 200 мл перфузионного раствора для каждого сердца.
Раствор Тирода (решение 2)	140 NaCl, 4 kCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 глюкозы	Который можно хранить в течение 3 дней при 4 °C. CaCl2 и глюкозу добавляют в день эксперимента, корректируют рН до 7,3-7,4 с насыщенным NaOH при комнатной температуре (28-30°C) с помощью PH-метра.

Таблица 1. Решения для изоляции СМ для взрослых мышей.

Решение	Содержание	знаменитый
Раствор для пищеварения (раствор 3)	25 мл раствора 1, 6 мкл 100 мМ/л CaCl2, 25 мг коллагеназы II, 50 мкл (2,5 % 10×) трипсина	для каждого сердца
Остановка решения 1 (решение 4)	9 мл раствора 1, 1 мл FBS (фетальная бычья сыворотка), 4мкл 100 мМ/л CaCl2	для каждого сердца
Остановка решения 2 (решение 5)	9,5 мл раствора 1, 0,5 мл FBS (фетальная бычья сыворотка), 4 мкл 100 мМ/л CaCl2	для каждого сердца
Раствор для повторного суспензии клеток (раствор 6)	13 мл раствора 1, 7мкл 1М/л CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) в дозе, которая может образовывать тонкий слой, покрывающий поверхность жидкости	для каждого сердца

Таблица 2. Решения для изоляции и хранения CM для взрослых.

Рисунок 9. Токо-вольтовые кривые натриевых каналов. Методы зажима цельноклеточного пластыря использовались для записи токов натрия изолированных кардиомиоцитов в режиме зажима напряжения. Протокол зажима напряжения показан во вставке. Показаны токи натрия, регистрируемые от AM (A) и VM (B). Плотности тока при потенциалах −45мВ, −40мВ и −35 мВ значительно выше в АМ (−32,71 ± 1,597 пА/пФ, −31,49 ± 1,820 пА/пФ и −29,34 ± 1,939 пА/пФ соответственно; n = 10), чем в ВМ (−17,66 пА/пФ ± 1,976 пА/пФ, −21,09 ± 1,560 пА/пФ и −21,86 ± 1,381 пА/пФ соответственно; n = 8; П < 0,05). (C) Кривые I-V показывают плотности тока натрия, которые были нормализованы до емкости ячейки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 10. Происхождение и распределение предсердного сосуда. Предсердный сосуд (стрелка 1) и СА (стрелка 2) на панели А. Панель Б представляет собой более пристальный взгляд на предсердный сосуд (стрелка 3). С) существуют две остии разного размера; один (стрелка 4) соответствует предсердному сосуду, орошавшему предсердные придатки, а другой (стрелка 5) соответствует СА (стереомикроскоп 10 × 5 увеличения). CA = коронарная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Серийный номер мышей			1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Глубина канюляции аорты находится на восходящей аорте			0.5	0.6	0.3	0.4	0.8	0.3	0.8	0.7	0.5	0.7
Глубина канюляции аорты находится у корня аорты			0.2	-0.1	0.1	0	-0.1	0.1	-0.2	0	-0.1	0

Таблица 3. Расстояние от кончика канюли до коронарной артерии остиум. Сердца мышей C57BL/6 (n = 20) использовались для канюляции и связывания аорты в глубинах восходящей аорты и корня аорты соответственно. Аорта анатомируется, и измерено расстояние от кончика канюли до остиума СА. Расстояние измеряется в миллиметрах, а положительные или отрицательные знаки представляют кончик канюли выше и ниже остиума СА соответственно.

Обсуждение

Одиночный КМ является ценным и незаменимым инструментом в исследованиях сердечной функции и заболеваний на клеточном ^{уровне20}. Следовательно, изоляция жизнеспособных КМ от сердец является начальным и наиболее важным шагом. Качество клеток является одним из существенных факторов, определяющих проведение успешных экспериментов, особенно в оптических и электрофизиологических экспериментах. По сравнению с КМ других животных, КМ грызунов более уязвимы к ишемии и гипоксии из-за более высокой концентрации внутриклеточных ионов натрия, что способствует притоку кальция через обменник Na⁺/^Ca2+21. Более того, количество АМ намного меньше, чем у виртуальных машин; таким образом, успешной изоляции чрезвычайно трудно достичь. Метод Лангендорфа отлично подходит для изоляции виртуальных машин на ^мышах22, но уровень успеха в изоляции AM низок, и доступно мало отчетов. Надлежащая глубина канюляции аорты также является важным фактором в получении идеальных виртуальных машин, помимо температуры, активности ферментов, рН и качества воды, используемой для подготовки буфера. Принцип метода Лангендорфа опирается на ретроградную перфузию сердца. При перфузии аортальный клапан закрывается; таким образом, перфусат проталкивается в коронарные артерии, доставляя раствор фермента через ветви сосудов, и ткань миокарда равномерно переваривается. Чтобы достичь такого рода циркуляции, аорта должна резервировать достаточную длину для канюляции и перевязки, также кончик канюли не должен проникать в аортальные клапаны или блокировать CA ostium. Таким образом, разумно предположить, что глубина канюляции аорты также связана с перфузией предсердий, которая аналогичным образом влияет на эффективность пищеварения предсердий и выход АМ. Протокол, представленный здесь, подтвердил гипотезу, и важные шаги для оптимизации выхода клеток вместе с предложениями отмечены ниже.

На этапе 1.9, чтобы лучше закрепить аорту, рекомендуется тупая канюля 20 G с выемкой (или окружной канавкой), откуда расстояние составляет 1 мм до кончика. Основываясь на нашем опыте, было обнаружено, что размер канюли, который немного больше диаметра аорты, предотвращает прокалывание кончиком канюли аортальных клапанов во время канюляции, потому что аорта, полагаясь на свою внутреннюю эластичность, может плотно вписываться в канюлю и производить трение, которое действует как защитный фактор при движении вперед или назад, регулируя глубину канюляции. С точки зрения положения выемки, сердце будет легко соскальзывать во время канюляции из-за гравитации, если оно находится слишком близко к кончику канюли. И наоборот, пространство для регулировки глубины канюляции и положения перевязки будет очень ограничено, хотя и слишком далеко. Учитывая эти обстоятельства, транссекция аорты между левой общей сонной артерией (как зеленая линия на рисунке 2) для обеспечения того, чтобы аорта была достаточно длинной и могла быть канюлирована и перевязана на восходящей аорте, лучше на шаге 3.3. В то время как трансекция на восходящей аорте, зарезервированная длина для канюляции, по крайней мере, может закрепить кончик канюли близко к корню аорты и не проникнет в аортальные клапаны после перевязки. Анатомия аорты и измерение расстояния от кончика канюли до остиума СА указывают на то, что транссекция аорты между левой общей сонной артерией является идеальным положением для достижения правильной глубины канюляции аорты.

Было обнаружено, что глубина каннуляции связана с перфузией предсердий, которая, в свою очередь, действует как индикатор глубины. На рисунке 4 показано, что перфузия предсердий хороша, когда глубина находится на восходящей аорте, а оба предсердных придатка раздуты. Однако перфузия предсердий недостаточна, когда глубина находится у корня аорты (или приближается к нему), и оба предсердных придатка увядшие. Общее и жизнеспособное количество АМ, полученное от раздутых предсердных придатков, было выше (рисунок 8). Эти результаты показывают, что глубина канюляции аорты может определенным образом влиять на перфузию и пищеварение предсердий и придатков предсердий и, наконец, влиять на урожайность и качество АМ. Было выведено, что выход и качество AM связаны с распределением сосудов, которые снабжают предсердия. Исследование Fernández et ^al.23 продемонстрировало различные аномалии в происхождении и течении СА мыши. Они обнаружили, что остии CA были очень изменчивыми и не все были расположены в пазухе аорты. Некоторые СА могут возникать аномально сверху пазух аорты, называемые остиумом высокого взлета. Некоторые СА могут происходить из одного и того же аортального синуса, а остиум сосуда предсердия находится совсем рядом. Анатомия аорты в настоящем исследовании (рисунок 10) также согласуется с открытием Фернандеса. Это может быть причиной того, что попытки изолировать AM методом Лангендорфа были в значительной степени безуспешными, если глубина канюляции не подходит. Таким образом, кончик канюли будет иметь больше шансов заблокировать остиум сосуда предсердий, который примыкает к остию СА, если между кончиком канюли и остиумом СА недостаточно места. Напротив, перфузия и выход клеток желудочка практически не были затронуты, пока аортальные клапаны не были пробиты кончиком канюли. Вероятно, это связано с тем, что СА, которые снабжают кровью желудочек, имеют большую остию и большее происхождение. Если один остиум был закупорен канюлей, перфузия желудочка может быть компенсирована другим СА или коллатеральным кровообращением, тогда как кровеносный сосуд, который снабжает предсердие, довольно мал и не имеет замены. Таким образом, влияние глубины на канюляцию аорты имеет важное значение.

Другие примечательные факторы и устранение неполадок в процессе пищеварения и хранения клеток перечислены ниже. Во-первых, рассмотрите возможность перфузии насыщенного кислородом раствора Тирода на этапе 4.1, чтобы заставить мышцу сокращаться и откачивать остаточную кровь, если кровь в предсердиях не была выброшена после перевязки аорты. Это может помочь избежать неблагоприятного воздействия ^ca2+ и других материалов, высвобождаемых из поврежденных эритроцитов. Во-вторых, перфузия ^ca2+ свободного раствора раньше времени для диссоциации связи и расширения пространства между клетками может повысить эффективность переваривания ферментов, поскольку интеркалированные диски между КМ являются кальциезависимыми межклеточными соединениями. Однако время должно быть ограничено 3-5 мин, чтобы избежать явления парадокса кальция24. Рекомендуется смешанный раствор ферментов. Коллагеназа типа II нарушает сеть внеклеточного матрикса, а трипсин помогает очистить гранулированный материал, который остается на поверхности клетки, если переваривание коллагеназы II неполное. Это обеспечивает гладкую поверхность ячейки, что имеет решающее значение для формирования уплотнения GΩ в записи патч-зажима. Тем не менее, концентрация трипсина должна контролироваться в надлежащем диапазоне, чтобы избежать чрезмерного пищеварения и повреждения клеток, потому что это может ухудшить мембранный белок. Использование только коллагеназы типа II для улучшения выхода клеток часто может привести к перевариванию тканей, а изолированные СМ будут непереносимыми кальцием после длительного воздействия коллагеназы25. Использование монооксима 2,3-бутандиона (BDM), вещества, которое предотвращает спонтанное сокращение путем ингибирования АТФазы миозина и предотвращения образования поперечных мостов26,27,28,29. Согласно предыдущему опыту, добавление BDM необходимо для этого протокола. Ферментный раствор готовят с раствором 1, хотя раствор 1 не содержит кальция, и кальций добавляют для активации фермента. Преимущество добавления БДМ в перфузионный раствор включает (1) ингибирование сокращения миоцитов и снижение потребления кислорода во время перфузии ферментного раствора и (2) предотвращение гипоксии миоцитов и улучшение качества выделенных миоцитов. В некоторых исследованиях сообщалось, что BDM может оказывать потенциальное неблагоприятное влияние на электрические свойства клеток. Однако результаты регистрации тока натрия цельноклеточным пластырем не указывали на нежелательный эффект. На этапе хранения клеток (этап 6) многочисленные исследования выбрали буфер KB, раствор без кальция, но с высокой концентрацией калия, в котором клетки могут поддерживать лучшее состояние, потому что они находятся в поляризованных и низких метаболических условиях. Однако гликокаликс клеточной мембраны будет отделяться от липидного бислоя при отсутствии экзогенного кальция в течение определенного промежутка времени и проницаемость мембраны будет увеличиваться, влияя на последующий функциональный анализ30,31,32.

Все методы выделения миоцитов в настоящее время могут быть по существу классифицированы либо как кусок (небольшой кусочек ткани) пищеварения в ферментативном растворе, либо перфузия СА с ферментативным раствором (перфузия Лангендорфа)²². По сравнению с методом Лангендорфа, метод сбраживания кусков легче выполнять, а также обычно используется для выделения КМ во многих лабораториях. Однако этот метод обычно дает низкий выход КМ низкого качества из взрослых ^{тканей22}. Более того, клетки, выделенные этим методом, могут не подходить для проведения сравнительных экспериментов. Например, при тестировании специфических для клеточных типов лекарственных эффектов между АМ и ВМ нельзя пренебрегать или исключать воздействие различных условий изоляции. Это связано с тем, что миокард и плотность тканей желудочка намного толще и плотнее, чем у предсердий, что приводит к различному времени переваривания и концентрации ферментов. Кроме того, чрезмерное перемешивание и пипетирование ткани во время пищеварения повредят клетки и значительно повлияют на функциональные исследования. Более того, многие предыдущие исследования показали, что ПМ более уязвимы к кальцию. Тем не менее, АМ, выделенные текущим протоколом, могут быть терпимы к градиентному реинтродукции кальция, вероятно, потому, что ткань легко разрывается в конце процесса пищеварения. Таким образом, механическое повреждение меньше, тогда как клетки будут страдать от большего количества механических повреждений, поскольку этапы метода куска нуждаются в повторном разрыве и центробежном. Совсем недавно Ackers et ^al.33 сообщили об упрощенном, свободном от Лангендорфа методе выделения жизнеспособных сердечных миоцитов и немиоцитов. Виртуальные машины и фибробласты могут быть эффективно изолированы, но количество АМ не упоминалось. Однако этот протокол имеет ряд ограничений. Во-первых, распределение кровеносных сосудов сердца может иметь вариации для индивидуальных различий и штамма мышей, а рекомендуемая глубина канюляции не может гарантировать успешную изоляцию ПМ для каждого раза. Во-вторых, для тех, кто новичок в этой процедуре, может потребоваться определенное количество времени, чтобы практиковать трансекцию аорты и ретроградную канюляцию аорты. Наконец, этот метод не был протестирован на других моделях сердечных заболеваний, за исключением здоровых и пожилых мышей. Следовательно, это потребует корректировки концентрации ферментов и времени пищеварения из-за степени фиброза сердца. Недостаток различных условий пищеварения, встречающихся в кусковом методе, не будет проблемой в методе Лангендорфа, в котором раствор фермента равномерно распределяется по тканям по слоям сосудов.

Таким образом, протоколы одновременной изоляции одного AM и VM, описанные здесь, продемонстрировали, что правильная глубина канюляции аорты может эффективно улучшить перфузию предсердий и выход AM. CM, выделенные этим методом, имеют высокое качество, обладают хорошей толерантностью к кальцию и успешно применяются для записи зажимов и обработки кальция (высвобождение ^{Ca2 +} и измерение волны ^{Ca2 +} системой IonOptix) в ^{команде34}. Предполагается, что протокол изоляции может быть использован для подготовки клеток в серии клеточных и субклеточных исследований, что поможет углубить понимание физиологии и патологии сердца. Важно отметить, что это позволит обнаружить более клинически значимые механизмы сердечных заболеваний и методы вмешательства.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,3-butanedione monoxime (BDM)	Sigma-Aldrich	31550
Bull Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Collagenase type II	Worthington	43D14160
Excel			data acquisition and analysis
Fetal Bovine Serum (FBS)	Zhejiang Tianhang Biotechnology	150207
Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
KHCO3	Sigma-Aldrich	237205
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S7907
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA,US		data acquisition and analysis
Peristaltic pump	Longerpump	BT100-2J
Sodium pentobarbital	Shanghai Reagent Factory	810923
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Trypan blue	Solarbio	C0040
Trypsin	Invitrogen	15090046
Water bath	JULABO	ED (v.2)