使用GCaMP3报告器测量心脏特异性钙通量，对心脏重编程进行体外评估

摘要

我们在这里描述了Tg（Myh6-cre）1Jmk/J /Gt（ROSA）^{26Sortm38（CAG-GCaMP3）Hze}/J（下面称为αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）小鼠报告线用于心脏重编程评估的建立和应用。从小鼠菌株中分离出的新生儿心脏成纤维细胞（NCF）转化为诱导心肌细胞（iCM），从而可以方便有效地评估通过钙（^{Ca2 +}）通量对iCM的重编程效率和功能成熟。

摘要

心脏重编程已成为修复受损心脏的潜在有希望的疗法。通过引入多种转录因子，包括Mef2c，Gata4，Tbx5（MGT），成纤维细胞可以重新编程为诱导心肌细胞（iCM）。这些iCM在梗死的心脏 中原位 产生时，与周围的心肌在电和机械上集成，导致疤痕大小的减小和心脏功能的改善。由于iCM的重编程效率、纯度和质量相对较低，iCM的表征仍然是一个挑战。该领域目前使用的方法包括流式细胞术、免疫细胞化学和qPCR，主要集中在心脏特异性基因和蛋白表达上，而不是iCM的功能成熟。由动作电位触发，心肌细胞中电压门控钙通道的打开导致钙快速流入细胞。因此，量化钙流入速率是评估心肌细胞功能的有希望的方法。在这里，该协议介绍了一种通过钙（^{Ca2 +}）通量评估iCM功能的方法。通过将Tg（Myh6-cre）1Jmk/J（下面称为Myh6-Cre）与Gt（ROSA）^{26Sortm38（CAG-GCaMP3）Hze}/J（下面称为Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）小鼠杂交，建立了αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠品系。分离来自P0-P2新生小鼠的新生儿心脏成纤维细胞（NCF） 并在体外培养，并将MGT的多顺式构建引入NCF，这导致它们重新编程为iCM。由于只有成功重编程的iCM才能表达GCaMP3报告基因，因此可以通过^{Ca2 +} 通量和荧光显微镜直观地评估iCM的功能成熟。与未重编程的NCF相比，NCF-iCM显示出显着的钙瞬时通量和自发收缩，类似于CM。该协议详细描述了小鼠品系的建立，新生小鼠心脏的分离和选择，NCF分离，用于心脏重编程的逆转录病毒的产生，iCM诱导，使用我们的报告线评估iCM ^{Ca2 +} 通量，以及相关的统计分析和数据呈现。预计这里描述的方法将为评估iCM的功能成熟度提供一个有价值的平台，用于心脏重编程研究。

引言

心肌梗死 （MI） 是世界范围内的一种严重疾病。心血管疾病 （CVD） 是全球主要死因，2019 年造成约 1860 万人死亡^1，2。在过去半个世纪中，心血管疾病的总死亡率有所下降。然而，在一些不发达国家，这一趋势已经放缓甚至逆转¹，这需要对心血管疾病进行更有效的治疗。作为心血管疾病的致命表现之一，在美国，心肌梗死约占 CVD 死亡总数的一半²。在缺血期间，随着冠状动脉阻塞以及营养和氧气供应有限，心肌发生严重的代谢变化，损害心肌细胞（CM）的收缩功能，并导致CM死亡³。心血管研究中已经探索了许多方法来修复心脏损伤并恢复受伤心脏的功能⁴。直接心脏重编程已成为修复受损心脏并恢复其功能的一种有希望的策略^5，6。通过引入Mef2c，Gata4，Tbx5（MGT），成纤维细胞可以在 体外 和 体内重新编程为iCM，这些iCM可以减少疤痕面积并改善心脏功能^7，8。

虽然心脏重编程是心肌梗死治疗的一种有前途的策略，但仍存在许多挑战。首先，重编程效率、纯度和质量并不总是像预期的那样高。MGT诱导只能达到总CF的8.4%（cTnT+）或24.7%（αMHC-GFP +），以在体外⁷重新编程为iCM7，或在体内高达35%⁸，这限制了其应用。即使系统中诱导了更多的因素，例如^Hand29或Akt1 / ^PKB10，重编程效率仍然勉强令人满意，无法在临床环境中使用。因此，该领域需要更多的研究来提高重编程效率。其次，iCM的电完整性和收缩特性对于有效改善心脏功能非常重要，但评估这些特性具有挑战性。目前，该领域广泛使用的评价方法，包括流式细胞术、免疫细胞化学、qPCR等一些关键CM基因表达，都集中在iCM和CM的相似性上，但与iCM的功能特征没有直接关系。此外，这些方法具有相对复杂的程序，并且非常耗时。虽然重编程研究通常涉及筛选促进iCM成熟的潜在重编程因子¹¹，但心脏重编程需要一种基于iCM功能的快速便捷的方法。

在每个收缩周期中，CM打开细胞膜上的电压门控钙离子通道，这导致钙离子（^{Ca2 +}）从细胞间液短暂流入细胞质以参与肌原收缩。这样的^Ca2+ 流入和流出循环是心肌收缩的基本特征，构成了^CMs12的正常功能。因此，检测^{Ca2 +} 流入的方法可能是测量CM和CM样细胞（包括iCM）功能的潜在方法。此外，对于iCM，这种方法提供了另一种评估重编程效率的方法。

遗传编码钙指示剂（GECI）已被开发并广泛用于指示细胞活性，特别是动作电位。通常，GECI由^{Ca2 +} 结合结构域（例如钙调蛋白）和荧光结构域（例如GFP）组成，而GCaMP3是具有高亲和力和荧光强度的结合结构域。当局部钙浓度改变时，GCaMP3的荧光结构域将被激活¹³。在本文中，描述了一种在Myh6 +细胞中特异性表达GCaMP3报告基因的小鼠品系。通过将MGT引入该菌株新生儿的分离NCF中，可以通过荧光监测重编程，成功重编程的iCM将表现出来。这种小鼠菌株和方法将为研究心脏重编程提供有价值的平台。

研究方案

所有涉及动物的实验程序和实践都得到了密歇根大学动物护理和使用委员会的批准。所有涉及细胞培养的实验程序和实践必须在无菌条件下进行BSL2生物安全柜。对于涉及病毒的程序和做法，遵循了正确处理转染细胞，移液器吸头和管子以避免环境和健康危害风险的指南。

1. 建立Tg（Myh6-cre）1Jmk/J /Gt（ROSA）26Sortm38^{（CAG-GCaMP3）Hze} /J（称为Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）小鼠品系（图1）

1. 分别制备Tg（Myh6-cre）1Jmk/J小鼠品系（杰克逊实验室储备009074，称为Myh6-Cre）和Gt（ROSA）^{26Sortm38（CAG-GCaMP3）Hze}/J小鼠品系（杰克逊实验室库存014538，称为Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3）。
2. 培育每个菌株至8周大，分别获得成年Myh6-Cre和Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠。
3. 杂交了成年Myh6-Cre和Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠。
   注意:设置Myh6-Cre公头/ Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3母头，反之亦然。它们的后代之间没有显着差异。通常，雌性小鼠将在杂交后19-21天生下8-10只幼崽。

2.新生儿Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠心脏的分离和选择。

1. 获得P0-P2幼崽。确保存在8-10只幼崽，以使用此方案隔离1000万个NCF。
2. 通过体温过低深度麻醉幼崽。将幼崽戴上乳胶手套，将幼崽浸入碎冰和水（2°C - 3°C）中，直到脖子。
3. 用75%乙醇对幼崽进行短暂消毒。
4. 用无菌剪刀斩首幼崽。
5. 在心脏附近做一个水平切口，挤压心脏，然后用剪刀在主动脉根部分离它。
6. 在荧光显微镜下观察心脏跳动。确保使用 Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 基因型的心脏显示 GCaMP3 指示的 ^Ca2+ 通量，伴有心脏跳动。其他基因型不显示荧光（图2， 视频1和 视频2）。

3. 新生儿心脏成纤维细胞（NCF）的分离

注:本部分，李谦博士的^Lab14 实验方案在适用于本研究时进行了小幅优化。

1. 在分离出αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3心脏后，将它们切成四块松散连接的碎片。在冰冷的DPBS中将它们在6厘米的板中彻底洗涤几次，以限制分离细胞中的血细胞污染。
2. 将心脏转移到15 mL锥形管中。
3. 用8毫升温热的0.25%胰蛋白酶-EDTA在37°C下消化心脏10分钟。
4. 丢弃胰蛋白酶上清液，在HBSS中加入5mL温热的II型胶原酶（0.5mg / mL）。
5. 彻底涡旋混合物，并在37°C孵育5分钟。
6. 孵育后，彻底涡旋，让未消化的组织在重力作用下沉降下来。
7. 将上清液收集在15 mL锥形管中，其中含有5 mL冷成纤维细胞（FB）培养基（IMDM与20%FBS和1%青霉素/链霉素）。
8. 对未消化的组织重复步骤3.4-3.74-5次。
9. 将所有上清液收集在一起，并用40μm过滤器过滤上清液。
10. 在4°C下以200× g 离心5分钟，弃去上清液。
11. 将细胞重悬于10mL磁性活化细胞分选缓冲液（MACS缓冲液;1x PBS，2mM EDTA和0.5%BSA）中。
12. 通过台盼蓝染色确定活细胞数。
    1. 在步骤3.11中从10mL细胞悬浮液中取出10μL细胞。
    2. 与10μL0.4%台盼蓝溶液混合，在室温下孵育5分钟。
    3. 将混合物加入血细胞计数器并确定活细胞数。死细胞被染成蓝色，而活细胞没有被染色。
13. 在4°C下以200× g 离心细胞5分钟并弃去上清液。
14. 将10μLThy1.2微珠重悬于90μL冷冻MACS缓冲液中，以重悬细胞，以处理少于1000万个活细胞。如果活细胞超过1000万个，则按比例添加更多磁珠。将混合物移液充分并在4°C下孵育30-60分钟。
15. 加入 10 mL MACS 缓冲液并充分混合。
16. 以200× g 离心5分钟，弃去上清液。
17. 重复步骤 3.15-3.16 一次。
18. 用2 mL MACS缓冲液重悬细胞和磁珠。
19. 在抽油烟机中设置 MACS 分离器。将LS色谱柱插入分离器，并用3 mL MACS缓冲液平衡色谱柱。
20. 当 LS 色谱柱达到平衡时，将细胞传递到色谱柱中。
21. 用2 mL MACS缓冲液洗涤LS色谱柱三次。
22. 将色谱柱从分离器中取出，用2 mL MACS缓冲液洗脱三次，然后将洗脱收集到50 mL管中。
23. 以200× g 离心5分钟并弃去上清液。
24. 用5mLFB培养基重悬细胞。
25. 用血细胞计数器确定细胞数。
26. 用FB培养基稀释细胞，并根据需要将细胞接种到培养皿或平板上。确保细胞接种密度约为2-2.5×¹⁰⁴ 个细胞/^cm2 （根据单个实验优化密度）。确保附着的成纤维细胞在接种后的第二天具有椭圆形至圆形（图3）。

4. 用于心脏重编程的逆转录病毒编码多顺电子MGT载体的生产

1. 在37°C和5%CO ₂下，用Plat-E培养基（DMEM补充10%FBS，1μg/ mL嘌呤霉素和10μg/mL杀胚素）维持Plat-E。
2. 在第1天，将Plat-E以大约4-5×¹⁰⁵ 个细胞/孔密度分裂到6孔板中。
3. 在第2天，Plat-E通常达到80%的汇合度。使用以下程序转染细胞。根据6孔板中的每个孔调整此处存在的每个元素的体积和数量。
   1. 用TE缓冲液将2μgpMX-puro-MGT多顺电子病毒表达质粒载体（Addgene 111809）稀释至500ng / μL。
   2. 通过将10μL脂质酰胺与150μL还原血清培养基混合来制备转染混合物。小心地移液以充分混合，并在室温下孵育5分钟。移液时要小心避免气泡。
   3. 同时，通过将质粒与150μL还原血清培养基混合来制备质粒混合物。小心地移液以充分混合，并在室温下孵育5分钟。移液时要小心避免气泡。
   4. 小心地混合两种混合物，并在室温下孵育5分钟。解决方案可能显示为阴天。
   5. 将混合物一滴一滴地添加到要转染的细胞中。
   6. 将细胞在37°C孵育过夜。
4. 第3天，将培养基更换为不含嘌呤霉素和杀菌素的新鲜完整细胞培养基。
5. 在转染后第4天，48小时，收集含有逆转录病毒的上清液并将其储存在4°C中。
6. 在转染后第5天，72小时，收集含有逆转录病毒的上清液。
7. 用0.45μm过滤器过滤48小时和72小时的上清液，通过加入1/5体积的40%聚（乙二醇）（PEG）溶液在4°C沉淀过夜，使最终浓度为8%的PEG。
8. 以4，000× g 离心30分钟以沉淀病毒。
   注意:PEG8000病毒形成小的白色沉淀。
9. 根据需要用含有8μg/ mL聚苯乙烯的iCM培养基重悬病毒。立即使用逆转录病毒。

5. 将NCF重新编程为具有MGT编码逆转录病毒感染的iCM

1. 在病毒感染之前生长或传代NCF。
   注意:通常，NCF可以传行两次。
2. 在第0天，在FB培养基中将NCF播种至密度约为1-2 x 10 ⁴ 个细胞/ cm ² 。
3. 在第1天，根据需要将培养基替换为每个孔的含病毒培养基。使用来自6孔板中一个孔Plat-E的病毒感染24孔板中的两个孔。滴定病毒以确定最佳病毒浓度。
   注意:包含其他感兴趣重编程因子的病毒可能与MGT逆转录病毒一起引入。
4. 在37°C孵育过夜。
5. 在病毒感染后第2天，24小时，将含病毒培养基更换为常规iCM培养基。
6. 为了监测GCaMP3表达，将其置于倒置荧光显微镜下。在GFP通道下10倍，早在第5天就观察到一部分细胞的轻度基础GCaMP3荧光。
7. 在重编程期间每2-3天更换一次培养基。如有必要，通过向培养基中加入2μg/ mL嘌呤霉素3天并将其维持在1μg/ mL，对MGT逆转录病毒感染细胞进行阳性选择。
   注:介绍感兴趣的化学品（例如，IGF-1、MM589、A83-01 和 PTC-209，正如我们之前报道的 ^IMAP15）以及介质变化。
8. 感染14天后，用B27培养基替换培养基以进一步诱导iCM成熟。

6. 通过^Ca2+ 助焊剂评估iCM功能成熟度和重编程效率

注意:如有必要，在评估前向待评估的细胞中加入1μM异丙肾上腺素。

1. 在室温下使用倒置荧光显微镜评估^{Ca2 +} 通量。
2. 在GFP通道中，观察10倍物镜下的GCaMP3 +细胞。确保它在明场通道中显示自发的细胞跳动。
3. 随机选择 20x 以下的三个场，并记录每个场的 iCM 的 ^Ca2+ 通量 3 分钟。
   注:此处，^Ca2+ 通量与自发细胞跳动同步（图4， 图5和 视频3，视频4，视频5，视频6，视频7，视频8）。
4. 用^{Ca2 +} 通量手动定量细胞。

7. 统计分析和数据呈现

1. 分析组之间的差异 单向方差分析 （ANOVA） 并执行 Student-Newman-Keuls 多重比较检验。
   注:结果与 S.E ±均值相同，p < 0.05 被认为具有统计学意义。每个实验至少进行三次。

结果

生成Myh6-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3小鼠品系的实验工作流程和转基因小鼠的基因结构如图1所示。在建立小鼠品系的同时，分离幼崽的心脏并在反向荧光显微镜下观察以确认基因型。具有正确基因型的心脏显示^{Ca2 +}通量与跳动同步，可视化为GCaMP3荧光，而在对照心脏中未观察到荧光（图2，视频1和视频2）。分离的NCF将在...

讨论

评估iCM功能对于心脏重编程领域是必要的。在这份手稿中，该协议描述了已经建立的Tg（Myh6-cre）1Jmk / J / Gt（ROSA）^{26Sortm38（CAG-GCaMP3）Hze} / J小鼠品系，如何使用从该菌株中新生小鼠分离的NCF进行重编程为iCM，以及通过^{Ca2 +} 通量评估iCM功能。这是一种评估iCM功能成熟的 从头开始 的方法。

几个关键步骤对于使用此方法成功重新编程和评估非常重要。首先，...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-70C
50mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-49A
6 Well Cell Culture Plates	Alkali Scientific	TP9006
A83-01	Stemgent	04–0014
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X800E	Inverted fluorescence microscope
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A1113903
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Thermo Fisher Scientific	BP9706100
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-049-101	Thy1.2 microbeads
Collagenase, Type 2	Thermo Fisher Scientific	NC9693955
Counting Chamber	Thermo Fisher Scientific	02-671-51B	Hemocytometer
DMEM, high glucose, no glutamine	Thermo Fisher Scientific	11960069
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14-040-133
Ethanol, 200 proof (100%)	Thermo Fisher Scientific	04-355-451
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)	Thermo Fisher Scientific	E478-500
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025092
IMDM media	Thermo Fisher Scientific	12440053
IX73 Inverted Microscope	Olympus	IX73P2F	Inverted fluorescence microscope
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11-668-019
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Medium 199, Earle's Salts	Thermo Fisher Scientific	11150059
MidiMACS Separator and Starting Kits	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore Sigma	SLHV033RB
MM589			Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31-985-070
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	Cell Biolabs	RV-101
pMx-puro-MGT	Addgene	111809
Poly(ethylene glycol)	Millipore Sigma	P5413-1KG	PEG8000
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G
PTC-209	Sigma	SML1143–5MG
Puromycin Dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A1113803
Recombinant Human IGF-I	Peprotech	100-11
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
ST 16 Centrifuge Series	Thermo Fisher Scientific	75-004-381
Sterile Cell Strainers	Thermo Fisher Scientific	22-363-547	40 µm strainer
Surface Treated Tissue Culture Dishes	Thermo Fisher Scientific	FB012921
TE Buffer	Thermo Fisher Scientific	12090015
Trypan Blue solution	Millipore Sigma	T8154
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365