Evaluación in vitro de la reprogramación cardíaca mediante la medición del flujo de calcio específico cardíaco con un informador GCaMP3

Resumen

Describimos aquí, el establecimiento y la aplicación de una línea de reportero de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (denominada αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación) para la evaluación de reprogramación cardíaca. Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) aislados de la cepa del ratón se convierten en cardiomiocitos inducidos (iCM), lo que permite una evaluación conveniente y eficiente de la eficiencia de reprogramación y la maduración funcional de los iCM a través del flujo de calcio (^{Ca2 +}).

Resumen

La reprogramación cardíaca se ha convertido en una terapia potencialmente prometedora para reparar un corazón dañado. Al introducir múltiples factores de transcripción, incluidos Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), los fibroblastos se pueden reprogramar en cardiomiocitos inducidos (iCM). Estos iCM, cuando se generan in situ en un corazón infartado, se integran eléctrica y mecánicamente con el miocardio circundante, lo que lleva a una reducción en el tamaño de la cicatriz y una mejora en la función cardíaca. Debido a la eficiencia, pureza y calidad de reprogramación relativamente bajas de los iCM, la caracterización de los iCM sigue siendo un desafío. Los métodos utilizados actualmente en este campo, incluida la citometría de flujo, la inmunocitoquímica y la qPCR, se centran principalmente en la expresión de genes y proteínas específicas del corazón, pero no en la maduración funcional de los iCM. Desencadenada por potenciales de acción, la apertura de canales de calcio dependientes de voltaje en los cardiomiocitos conduce a una rápida afluencia de calcio en la célula. Por lo tanto, cuantificar la tasa de afluencia de calcio es un método prometedor para evaluar la función de los cardiomiocitos. Aquí, el protocolo introduce un método para evaluar la función de iCM por flujo de calcio (^Ca2+). Se estableció una cepa de ratón αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 cruzando ratones Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (denominado Myh6-Cre a continuación) con ratones Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (denominados Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a continuación). Los fibroblastos cardíacos neonatales (NCF) de ratones neonatales P0-P2 se aislaron y cultivaron in vitro, y se introdujo una construcción policistrónica de MGT en los NCF, lo que llevó a su reprogramación a iCM. Debido a que solo los iCM reprogramados con éxito expresarán el reportero GCaMP3, la maduración funcional de los iCM se puede evaluar visualmente mediante flujo de ^{Ca2 +} con microscopía de fluorescencia. En comparación con los NCF no reprogramados, los NCF-iCM mostraron un flujo transitorio significativo de calcio y una contracción espontánea, similar a los CM. Este protocolo describe en detalle el establecimiento de cepas de ratones, el aislamiento y la selección de corazones de ratones neonatales, el aislamiento de NCF, la producción de retrovirus para la reprogramación cardíaca, la inducción de iCM, la evaluación del flujo de ^{Ca2 +} de iCM utilizando nuestra línea reportera, y el análisis estadístico relacionado y la presentación de datos. Se espera que los métodos descritos aquí proporcionen una plataforma valiosa para evaluar la maduración funcional de los iCM para estudios de reprogramación cardíaca.

Introducción

El infarto de miocardio (IM) es una enfermedad grave en todo el mundo. Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte en todo el mundo y representan aproximadamente 18,6 millones de muertes en 20191,2. La mortalidad total de las ECV ha disminuido durante el último medio siglo. Sin embargo, esta tendencia se ha ralentizado o incluso revertido en algunos países subdesarrollados1, lo que exige tratamientos más eficaces de las ECV. Como una de las manifestaciones fatales de las ECV, el IM representa aproximadamente la mitad de todas las muertes atribuidas a las ECV en los Estados ^Unidos2. Durante la isquemia, con el bloqueo de las arterias coronarias y el suministro limitado de nutrientes y oxígeno, el miocardio sufre cambios metabólicos severos, deteriora la función sistólica de los cardiomiocitos (CM) y conduce a la muerte de la ^CM3. Se han explorado numerosos enfoques en la investigación cardiovascular para reparar la lesión cardíaca y restaurar la función del corazón ^lesionado4. La reprogramación cardíaca directa se ha convertido en una estrategia prometedora para reparar el corazón dañado y restaurar su ^función5,6. Al introducir Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), los fibroblastos pueden reprogramarse a iCM in vitro e in vivo, y esos iCM pueden reducir el área de la cicatriz y mejorar la función ^cardíaca7,8.

Aunque la reprogramación cardíaca es una estrategia prometedora para el tratamiento del IM, sigue habiendo una serie de desafíos. En primer lugar, la eficiencia, la pureza y la calidad de la reprogramación no siempre son tan altas como se esperaba. La inducción de MGT solo puede alcanzar el 8,4% (cTnT+) o el 24,7% (αMHC-GFP+) del total de CF que se reprogramarán a iCM in vitro7, o hasta el 35% in ^vivo8, lo que limita su aplicación. Incluso con más factores inducidos en el sistema, como ^Hand29 o Akt1 / ^PKB10, la eficiencia de reprogramación sigue siendo apenas satisfactoria para ser utilizada en un entorno clínico. Por lo tanto, se necesitan más estudios centrados en mejorar la eficiencia de la reprogramación en este campo. En segundo lugar, la integridad eléctrica y las características de contracción de los iCM son importantes para la mejora eficiente de la función cardíaca, sin embargo, son difíciles de evaluar. Actualmente, los métodos de evaluación ampliamente utilizados en el campo, incluida la citometría de flujo, la inmunocitoquímica y la qPCR de la expresión de algunos genes clave de CM, se centran en la similitud de los MCi y los CM, pero no están directamente relacionados con las características funcionales de los MCI. Además, esos métodos tienen procedimientos relativamente complicados y requieren mucho tiempo. Mientras que los estudios de reprogramación generalmente implican una detección de posibles factores de reprogramación que promueven la maduración de los ^iCM11, la reprogramación cardíaca requiere un método rápido y conveniente basado en la función de los iCM.

Los CM abren los canales iónicos de calcio dependientes de voltaje en la citomembrana durante cada ciclo de contracción, lo que conduce a una afluencia transitoria de iones de calcio (^{Ca2 +}) desde el líquido intercelular al citoplasma para participar en la contracción del miofilamento. Tal ciclo de afluencia y salida de ^Ca2+ es el rasgo fundamental de la contracción miocárdica y constituye la función normal de los ^CM12. Por lo tanto, un método que detecte la afluencia de ^{Ca2 +} podría ser una forma potencial de medir la función de los CM y las células similares a CM, incluidos los iCM. Además, para los iCM, este método proporciona otra forma de evaluar la eficiencia de la reprogramación.

Los indicadores de calcio codificados genéticamente (GECI) se han desarrollado y utilizado ampliamente para indicar las actividades celulares, especialmente los potenciales de acción. En general, los GECI consisten en un dominio de unión a ^{Ca2 +} como la calmodulina, y un dominio fluorescente como GFP, y GCaMP3 es uno con alta afinidad e intensidad de fluorescencia. El dominio de fluorescencia de GCaMP3 se activará cuando se cambie la concentración local de ^calcio13. En este artículo, se describe una cepa de ratón que expresa específicamente un reportero GCaMP3 en células Myh6+. Al introducir MGT en los NCF aislados de neonatos de esta cepa, la reprogramación puede ser monitoreada por fluorescencia, que exhibirá iCM reprogramados con éxito. Tal tensión y método de ratón proporcionará una plataforma valiosa para investigar la reprogramación cardíaca.

Protocolo

Todos los procedimientos y prácticas experimentales que involucran animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan. Todos los procedimientos y prácticas experimentales que impliquen cultivo celular deben realizarse en el Gabinete de Seguridad Biológica BSL2 en condiciones estériles. Para los procedimientos y prácticas que involucran virus, se siguió la directriz de la eliminación adecuada de las células transfectadas, las puntas de las pipetas y los tubos para evitar el riesgo de peligros ambientales y para la salud.

1. Establecimiento de una cepa de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38^{(CAG-GCaMP3)Hze} /J (denominada Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) (Figura 1)

1. Prepare la cepa de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (cepa de ratón Jackson lab stock 009074, denominada Myh6-Cre) y Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (cepa de ratón Jackson lab stock 014538, denominada Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), respectivamente.
2. Críe cada cepa hasta las 8 semanas de edad para obtener ratones adultos Myh6-Cre y Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, respectivamente.
3. Cruza los ratones adultos Myh6-Cre y Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.
   NOTA: Configure Myh6-Cre macho / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 hembra o viceversa. No hay diferencias significativas entre sus descendientes. Por lo general, los ratones hembra darán a luz a 8-10 cachorros 19-21 días después del cruce.

2. Aislamiento y selección de corazones de ratones neonatales Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.

1. Obtener cachorros P0-P2. Asegúrese de que 8-10 cachorros estén presentes para aislar a 10 millones de NCF con este protocolo.
2. Anestesiaba profundamente a los cachorros por hipotermia. Coloque a los cachorros en un guante de látex y sumérjalos hasta el cuello en hielo picado y agua (2 ° C - 3 ° C).
3. Desinfecte brevemente a los cachorros con etanol al 75%.
4. Sacrifica a los cachorros por decapitación con tijeras estériles.
5. Haga una incisión horizontal cerca del corazón, apriete el corazón y luego aíslelo separándolo en la raíz de la aorta con tijeras.
6. Observe los latidos del corazón bajo un microscopio de fluorescencia. Asegúrese de que los corazones con el genotipo Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 muestren un flujo de ^Ca2+ indicado por GCaMP3 con latidos cardíacos. Los otros genotipos no muestran fluorescencia (Figura 2, Video 1 y Video 2).

3. Aislamiento de fibroblastos cardíacos neonatales (NCF)

NOTA: Para esta parte, se adoptó el protocolo ^Lab14 del Dr. Li Qian con optimizaciones menores cuando se aplica a este estudio.

1. Después del aislamiento de los corazones αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, córtelos en cuatro pedazos que estén conectados libremente. Lávelos en DPBS helados en una placa de 6 cm a fondo varias veces para limitar la contaminación de las células sanguíneas en las células aisladas.
2. Transfiera los corazones a un tubo cónico de 15 ml.
3. Digiera los corazones con 8 ml de tripsina-EDTA caliente al 0,25% a 37 °C durante 10 min.
4. Deseche el sobrenadante de tripsina y agregue 5 ml de colagenasa tipo II caliente (0,5 mg/ml) en HBSS.
5. Vórtice bien la mezcla e incube a 37 °C durante 5 min.
6. Después de la incubación, vórtice a fondo y deje que el tejido no digerido se asiente por gravedad.
7. Recoger el sobrenadante en un tubo cónico de 15 ml con 5 ml de medio de fibroblastos fríos (FB) (IMDM con 20% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina).
8. Repita los pasos 3.4-3.7 para el tejido no digerido 4-5 veces.
9. Recoge todo el sobrenadante y filtra el sobrenadante con un colador de 40 μm.
10. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
11. Resuspend las células en 10 mL de tampón de clasificación celular activado magnéticamente (tampón MACS; 1x PBS con 2 mM EDTA y 0.5% BSA).
12. Determine el número de células viables mediante tinción azul tripano.
    1. Tome 10 μL de células de 10 ml de suspensión celular en el paso 3.11.
    2. Mezclar con 10 μL de solución de azul de tripano al 0,4% e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Agregue la mezcla a un hemocitómetro y determine el número de células viables. Las células muertas están teñidas de azul, mientras que las células viables no están teñidas.
13. Centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 4 °C y desechar el sobrenadante.
14. Resuspend las células con 10 μL de ti1.2 microperlas en 90 μL de tampón MACS refrigerado para menos de 10 millones de células viables. Agregue más cuentas proporcionalmente si hay más de 10 millones de células viables. Pipetear bien la mezcla e incubar a 4 °C durante 30-60 min.
15. Agregue 10 ml de búfer MACS y mezcle bien.
16. Centrifugar a 200 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante.
17. Repita los pasos 3.15-3.16 una vez.
18. Resuspend las celdas y cuentas con 2 ml de búfer MACS.
19. Configure un separador MACS en la campana. Inserte una columna LS en el separador y equilibre la columna con 3 ml de búfer MACS.
20. Cuando la columna LS esté equilibrada, pase las celdas a través de la columna.
21. Lave la columna LS con 2 ml de búfer MACS tres veces.
22. Retire la columna del separador, elútela con 2 ml de búfer MACS tres veces y luego recoja la elución en un tubo de 50 ml.
23. Centrifugar a 200 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
24. Resuspendir las células con 5 ml de medios FB.
25. Determine el número de célula con un hemocitómetro.
26. Diluya las células con medios FB y selle las células en platos o placas según lo desee. Asegúrese de que la densidad de siembra celular sea de alrededor de 2-2.5 x ¹⁰⁴ células / ^cm2 (optimice la densidad en función de experimentos individuales). Asegúrese de que los fibroblastos unidos tengan una forma ovalada a redonda el segundo día después de la siembra (Figura 3).

4. Producción de retrovirus que codifica el vector MGT policistrónico para la reprogramación cardíaca

1. Mantener Plat-E con medios de cultivo Plat-E (DMEM suplementado con 10% fbs, 1 μg/mL de puromicina y 10 μg/mL de blasticidina) a 37 °C con 5% de _CO2.
2. El día 1, divida Plat-E en una placa de 6 pocillos con una densidad de aproximadamente 4-5 x ¹⁰⁵ células/pozo.
3. En el día 2, Plat-E generalmente alcanza el 80% de confluencia. Transfectar las células con los siguientes procedimientos. Ajuste el volumen y la cantidad de cada elemento presente aquí en función de cada pozo en una placa de 6 pocillos.
   1. Diluir 2 μg de vector plásmido de expresión de retrovirus policistrónico pMX-puro-MGT (Addgene 111809) a 500 ng/μL con tampón TE.
   2. Preparar la mezcla de transfección mezclando 10 μL de Lipofectamina con 150 μL de medio sérico reducido. Pipetear cuidadosamente para mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Tenga cuidado de evitar las burbujas al pipetear.
   3. Mientras tanto, prepare una mezcla de plásmidos mezclando el plásmido con 150 μL de medio sérico reducido. Pipetear cuidadosamente para mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Tenga cuidado de evitar las burbujas al pipetear.
   4. Mezcle cuidadosamente las dos mezclas e incube a temperatura ambiente durante 5 min. La solución puede parecer turbia.
   5. Añadir la mezcla gota a gota a las células a transfectar.
   6. Incubar las células a 37 °C durante la noche.
4. El día 3, cambie el medio a un medio de cultivo celular completo fresco que carezca de puromicina y blasticidina.
5. El día 4, 48 h después de la transfección, recoger el sobrenadante que contiene retrovirus y almacenarlo a 4 °C.
6. El día 5, 72 h después de la transfección, recoger el sobrenadante que contiene retrovirus.
7. Filtre el sobrenadante de 48 h y 72 h con un filtro de 0,45 μm, precipite durante la noche a 4 °C agregando 1/5 de volumen de solución de poli (etilenglicol) (PEG) al 40% para hacer una concentración final de 8% de PEG.
8. Centrifugar a 4.000 x g durante 30 min para precipitar el virus.
   NOTA: PEG8000-virus forma una pequeña precipitación blanca.
9. Resuspend el virus con medio iCM que contenga 8 μg/mL de polibreno según se desee. Use el retrovirus inmediatamente.

5. Reprogramación de NCF a iCM con MGT que codifica la infección por retrovirus

1. Cultivar o pasar NCF antes de la infección por virus.
   NOTA: Por lo general, NCF se puede pasar dos veces.
2. En el día 0, sembrar NCF a la densidad alrededor de 1-2 x ¹⁰⁴ células/^cm2 en medio FB.
3. El día 1, reemplace el medio de cultivo con un medio que contenga virus para cada pozo que desee. Use el virus de un pocillo Plat-E en una placa de 6 pocillos para infectar dos pocillos en una placa de 24 pocillos. Titule el virus para determinar la concentración óptima del virus.
   NOTA: Los virus que contienen otros factores de reprogramación de interés podrían introducirse junto con el retrovirus MGT.
4. Incubar a 37 °C durante la noche.
5. El día 2, 24 h después de la infección por el virus, reemplace el medio que contiene el virus por un medio iCM normal.
6. Para monitorear la expresión de GCaMP3, colóquela bajo un microscopio de fluorescencia invertida. Bajo 10x en el canal GFP, observe la fluorescencia basal leve de GCaMP3 de una porción de células ya en el día 5.
7. Reemplace el medio cada 2-3 días durante la reprogramación. Si es necesario, realice una selección positiva para las células infectadas por el retrovirus MGT agregando 2 μg/ ml de puromicina al medio de cultivo durante 3 días y manteniéndolo a 1 μg / ml.
   NOTA: Introducir productos químicos de interés (por ejemplo, IGF-1, MM589, A83-01 y PTC-209, conocidos como IMAP como informamos ^{anteriormente15}) junto con el cambio de medio.
8. Después de 14 días de infección, reemplace el medio con medio B27 para inducir aún más la maduración de iCM.

6. Evaluación de la maduración funcional de iCM y eficiencia de reprogramación por flujo de ^Ca2+

NOTA: Agregue 1 μM de isoproterenol a las células que se evaluarán antes de la evaluación, si es necesario.

1. Evalúe el flujo ^{de Ca2+} con un microscopio de fluorescencia invertida a temperatura ambiente.
2. En el canal GFP, observe las células GCaMP3+ bajo el objetivo 10x. Asegúrese de que muestre el latido espontáneo de la célula en el canal de campo brillante.
3. Seleccione aleatoriamente tres campos por debajo de 20x y registre el flujo de ^Ca2+ de los iCM durante 3 minutos para cada campo.
   NOTA: Aquí, el flujo de ^Ca2+ se sincronizó con el latido espontáneo de las células (Figura 4, Figura 5 y Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7, Video 8).
4. Cuantificar manualmente las células con flujo de ^Ca2 +.

7. Análisis estadístico y presentación de datos

1. Analizar las diferencias entre los grupos de análisis unidireccional de varianza (ANOVA) y realizar las pruebas de comparación múltiple de Student-Newman-Keuls.
   NOTA: Los resultados son como media ± S.E con p < 0,05 considerados estadísticamente significativos. Cada experimento se realizó al menos tres veces.

Resultados

El flujo de trabajo experimental para generar la cepa de ratón Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 y la estructura genética de los ratones transgénicos se muestra en la Figura 1. Mientras se establece la cepa de ratón, los corazones de las crías fueron aislados y observados bajo un microscopio de fluorescencia inversa para confirmar el genotipo. Los corazones con el genotipo correcto muestran un flujo de ^Ca2+ sincronizado con los latidos, visualizado como fluorescencia GCa...

Discusión

La evaluación de la función de los iCM es necesaria para el campo de la reprogramación cardíaca. En este manuscrito, el protocolo describe una cepa de ratón Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J cepa de ratón que se ha establecido, cómo utilizar los NCF aislados de los ratones neonatales en esta cepa para la reprogramación a iCM, y la evaluación de la función de iCM por flujo de ^Ca2+ . Este es un método de novo para evaluar la maduración funcional de los iCM.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-70C
50mL Conical Centrifuge Tubes	Thermo Fisher Scientific	14-959-49A
6 Well Cell Culture Plates	Alkali Scientific	TP9006
A83-01	Stemgent	04–0014
All-in-One Fluorescence Microscope	Keyence	BZ-X800E	Inverted fluorescence microscope
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Blasticidin S HCl (10 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A1113903
Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Thermo Fisher Scientific	BP9706100
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec	130-049-101	Thy1.2 microbeads
Collagenase, Type 2	Thermo Fisher Scientific	NC9693955
Counting Chamber	Thermo Fisher Scientific	02-671-51B	Hemocytometer
DMEM, high glucose, no glutamine	Thermo Fisher Scientific	11960069
DPBS, calcium, magnesium	Thermo Fisher Scientific	14-040-133
Ethanol, 200 proof (100%)	Thermo Fisher Scientific	04-355-451
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (Certified ACS)	Thermo Fisher Scientific	E478-500
Fetal Bovine Serum	Corning	35-010-CV
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	14025092
IMDM media	Thermo Fisher Scientific	12440053
IX73 Inverted Microscope	Olympus	IX73P2F	Inverted fluorescence microscope
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	11-668-019
LS Columns	Miltenyi Biotec	130-042-401
Medium 199, Earle's Salts	Thermo Fisher Scientific	11150059
MidiMACS Separator and Starting Kits	Miltenyi Biotec	130-042-302
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized	Millipore Sigma	SLHV033RB
MM589			Obtained from Dr. Shaomeng Wang’s lab in University of Michigan
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31-985-070
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10-010-049
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122
Platinum-E (Plat-E) Retroviral Packaging Cell Line	Cell Biolabs	RV-101
pMx-puro-MGT	Addgene	111809
Poly(ethylene glycol)	Millipore Sigma	P5413-1KG	PEG8000
Polybrene Infection / Transfection Reagent	Millipore Sigma	TR-1003-G
PTC-209	Sigma	SML1143–5MG
Puromycin Dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A1113803
Recombinant Human IGF-I	Peprotech	100-11
RPMI 1640 Medium	Thermo Fisher Scientific	11875093
ST 16 Centrifuge Series	Thermo Fisher Scientific	75-004-381
Sterile Cell Strainers	Thermo Fisher Scientific	22-363-547	40 µm strainer
Surface Treated Tissue Culture Dishes	Thermo Fisher Scientific	FB012921
TE Buffer	Thermo Fisher Scientific	12090015
Trypan Blue solution	Millipore Sigma	T8154
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25300054
Vortex Mixer	Thermo Fisher Scientific	02215365