Évaluation in vitro de la reprogrammation cardiaque en mesurant le flux de calcium spécifique cardiaque avec un rapporteur GCaMP3

Zhaokai Li; Liu Liu; Zhong Wang

doi:10.3791/62643

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Évaluation in vitro de la reprogrammation cardiaque en mesurant le flux de calcium spécifique cardiaque avec un rapporteur GCaMP3

DOI:

10.3791/62643

⸱

February 22nd, 2022

Zhaokai Li*¹^,², Liu Liu*¹, Zhong Wang¹

¹Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University

* Ces auteurs ont contribué à parts égales

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Résumé

Nous décrivons ici l’établissement et l’application d’une ligne de rapporteur de souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (appelée αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous) pour l’évaluation de la reprogrammation cardiaque. Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) isolés de la souche de souris sont convertis en cardiomyocytes induits (iMC), ce qui permet une évaluation pratique et efficace de l’efficacité de la reprogrammation et de la maturation fonctionnelle des iMC via un flux de calcium (^Ca2+).

Résumé

La reprogrammation cardiaque est devenue une thérapie potentiellement prometteuse pour réparer un cœur endommagé. En introduisant plusieurs facteurs de transcription, y compris Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), les fibroblastes peuvent être reprogrammés en cardiomyocytes induits (iCM). Ces iMC, lorsqu’ils sont générés in situ dans un cœur infarctus, s’intègrent électriquement et mécaniquement au myocarde environnant, entraînant une réduction de la taille des cicatrices et une amélioration de la fonction cardiaque. En raison de l’efficacité, de la pureté et de la qualité relativement faibles de la reprogrammation des iMC, la caractérisation des iMC reste un défi. Les méthodes actuellement utilisées dans ce domaine, y compris la cytométrie en flux, l’immunocytochimie et la qPCR, se concentrent principalement sur l’expression des gènes et des protéines spécifiques au cœur, mais pas sur la maturation fonctionnelle des iCM. Déclenchée par des potentiels d’action, l’ouverture de canaux calciques voltage-dépendants dans les cardiomyocytes entraîne un afflux rapide de calcium dans la cellule. Par conséquent, quantifier le taux d’afflux de calcium est une méthode prometteuse pour évaluer la fonction cardiomyocytaire. Ici, le protocole introduit une méthode pour évaluer la fonction iCM par flux de calcium (^Ca2+). Une souche de souris αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 a été établie en croisant des souris Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (appelée Myh6-Cre ci-dessous) avec des souris Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (appelées Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ci-dessous). Les fibroblastes cardiaques néonatals (NCF) de souris néonatales P0-P2 ont été isolés et cultivés in vitro, et une construction polycistronique de MGT a été introduite dans les NCF, ce qui a conduit à leur reprogrammation en iCM. Étant donné que seuls les iCM reprogrammés avec succès exprimeront le rapporteur GCaMP3, la maturation fonctionnelle des iCM peut être évaluée visuellement par flux ^Ca2+ avec microscopie à fluorescence. Par rapport aux NCF non reprogrammés, les NCF-iCM ont montré un flux transitoire de calcium significatif et une contraction spontanée, similaires aux CM. Ce protocole décrit en détail l’établissement de la souche de souris, l’isolement et la sélection des cœurs de souris néonatales, l’isolement NCF, la production de rétrovirus pour la reprogrammation cardiaque, l’induction iCM, l’évaluation du flux iCM ^Ca2+ à l’aide de notre ligne de rapporteurs, ainsi que l’analyse statistique et la présentation des données connexes. On s’attend à ce que les méthodes décrites ici fournissent une plate-forme précieuse pour évaluer la maturation fonctionnelle des iCM pour les études de reprogrammation cardiaque.

Introduction

L’infarctus du myocarde (IM) est une maladie grave dans le monde entier. Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès dans le monde et représentent environ 18,6 millions de décès en 20191,2. La mortalité totale des MCV a diminué au cours du dernier demi-siècle. Cependant, cette tendance a été ralentie, voire inversée, dans certains pays sous-développés1, ce qui nécessite des traitements plus efficaces des MCV. En tant que l’une des manifestations mortelles des MCV, l’IM représente environ la moitié de tous les décès attribués aux MCV aux États-Unis2.