Алгоритм анализа изображений на основе зон для количественной оценки кокультур макрофаг-фибробластов

Резюме

Мы представляем метод, который использует обобщающий подход к анализу изображений на основе площади для определения количества клеток. Анализ различных клеточных популяций использовал значительные различия в высоте и структуре клеток между различными типами клеток в рамках адаптивного алгоритма.

Аннотация

Количественная оценка клеток необходима для широкого спектра биологических и биохимических исследований. Обычный анализ изображений клеток обычно использует либо подходы к обнаружению флуоресценции, такие как иммунофлуоресцентное окрашивание или трансфекция флуоресцентными белками или методы обнаружения краев, которые часто подвержены ошибкам из-за шума и других неидеальностей на фоне изображения.

Мы разработали новый алгоритм, который может точно подсчитывать и различать макрофаги и фибробласты, клетки разных фенотипов, которые часто колокализуются во время регенерации тканей. MATLAB был использован для реализации алгоритма, который дифференцировал различные типы клеток на основе различий в высоте от фона. Первичный алгоритм был разработан с использованием зонально-ориентированного метода для учета изменений в размере/структуре клеток и условиях посева с высокой плотностью.

Неидеальности в клеточных структурах были учтены с помощью вторичного, итеративного алгоритма, использующего внутренние параметры, такие как покрытие клеток, рассчитанное с использованием экспериментальных данных для данного типа клеток. Наконец, анализ сред кокультуры проводили с использованием алгоритма изоляции, в котором выборочно исключались различные типы клеток на основе оценки относительных перепадов высот внутри изображения. Было обнаружено, что этот подход точно подсчитывает клетки в пределах 5% погрешности для монокультурных клеток и в пределах 10% погрешности для кокутивируемых клеток.

Введение

Программное обеспечение регулярно внедряется во время методов анализа изображений, чтобы гарантировать, что результаты являются точными, эффективными и непредвзятыми. Для клеточных анализов общей проблемой является неправильная идентификация клеток. Изображения с неправильными фокальными и контрастными настройками могут привести к размытию клеток, при котором границу отдельных клеток становится трудно идентифицировать¹. Наличие посторонних признаков изображения, таких как поры, пузырьки или другие нежелательные объекты, может затруднить процедуры подсчета, замедляя процесс подсчета и приводя к неправильной идентификации. Кроме того, подсчет клеток может быть обременительным, а подсчет сотен реплик может быть чрезвычайно трудоемким. Кроме того, при ручном подсчете существует присущая ему субъективная предвзятость, и поэтому принятие решений относительно идентификации клеток часто является неточным². Автоматизированное программное обеспечение предлагает захватывающий потенциал для обхода всех этих проблем путем быстрой и точной дифференциации клеток от посторонних объектов, включая объекты, далеко выходящие за пределы человеческих возможностей для точного обнаружения, на основе четко определенных критериев идентификации, которые уменьшают влияние предвзятости исследователя. Общие методы идентификации клеток с использованием автоматизированного программного обеспечения включают два основных метода: сегментацию и пороговое значение³. Здесь мы демонстрируем обобщаемый протокол на основе области, который обеспечивает быстрый, точный и недорогой подсчет клеток в широко доступной программной среде.

Методы сегментации, такие как обнаружение краев, направлены на изоляцию отдельных клеток, используя различия интенсивности в изображении. Изменения интенсивности, которые отличают клетку от остальной части изображения, чаще всего состоят из резких изменений яркости⁴. Обнаружение краев включает в себя этап регуляризации фильтрации, за которым следует этап дифференциации, на котором обнаруживаются изменения интенсивности. Процесс дифференцировки идентифицирует края и контуры в изображении высокоинтенсивных изменений, и эти края и контуры коррелируют с присутствием клеток. Хотя изображения с шумом могут быть запущены через алгоритмы шумоподавления⁴, методы обнаружения краев идеально используются для анализа изображений с низким фоновым шумом. Процесс функционирует оптимально, когда границы ячеек четко и легко различимы и не затруднены контурами яркости, не связанными с присутствием клеток, размытием клеток, посторонними объектами или определенными внутренними клеточными структурами ^1,2. Если изображение особенно шумное, клетки могут быть дополнительно различимы с помощью флуоресцентного окрашивания или трансфекции флуоресцентными белками ^2,5. Хотя это значительно повышает точность методов сегментации, это требует дополнительных затрат и дополнительных затрат времени для подготовки клеточных культур к визуализации.

Методы порогового значения включают разделение изображения на две категории: передний план и фон, причем ячейки назначаются переднему плану³. Эти методы используют изменения цвета/контраста для определения видимой высоты объекта; Объекты, которые обычно «выше», чем фон, могут быть легко идентифицированы как клетки. Водораздел функционирует таким образом, связывая поверхности со светлыми пикселями в качестве переднего плана и с темными пикселями в качестве фона ^6,7. Благодаря идентификации на основе высоты методы пороговых значений могут обычно отличать шум от желаемых объектов, при условии, что они существуют в одной фокальной плоскости. В сочетании с зональной количественной оценкой преобразование водораздела может точно идентифицировать группы объектов в средах, где типичные методы сегментации, такие как обнаружение краев, были бы неточными.

Водосборные преобразования обычно сочетаются с методами сегментации для подготовки изображений к более чистому анализу, что приводит к более высокой точности подсчета клеток. Для этого процесса преобразование водораздела используется для выделения потенциальных областей, представляющих интерес, до сегментации. Преобразование водораздела обеспечивает уникальные преимущества, идентифицируя клетки на переднем плане изображений, что может повысить точность анализа сегментации за счет удаления потенциальных ложных срабатываний для клеток, таких как неравномерные участки фона. Тем не менее, трудности могут возникнуть при попытке адаптировать изображения на основе клеток к преобразованию водораздела. Изображения с высокой плотностью клеток могут страдать от недостаточной сегрегации, в которой агрегаты клеток идентифицируются как единичная группа, а не как отдельные компоненты. Наличие шума или резких изменений интенсивности также может привести к пересегментации, при которой алгоритм переувлажняет клетки, что приводит к чрезмерному и неточному количеству клеток⁸.

Здесь мы подробно описываем метод минимизации первичных недостатков преобразования водораздела путем включения компонентов порогового анализа в алгоритм количественной оценки на основе площади, как показано на рисунке 1. Примечательно, что этот алгоритм был реализован с открытым исходным кодом и / или широко доступным программным обеспечением, и применение этой структуры подсчета клеток было возможно без дорогостоящих реагентов или сложных методов подготовки клеток. Макрофаги RAW264.7 были использованы для демонстрации метода в связи с их критической ролью в регуляции процессов поддержания соединительной ткани и заживления ран⁹. Кроме того, были проанализированы фибробласты NIH/3T3 из-за их ключевой роли в поддержании и восстановлении тканей. Клетки фибробластов часто сосуществуют с макрофагами и поддерживают их, что вызывает необходимость различать эти фенотипически различные типы клеток в исследованиях кокультуры.

Количество клеток из изображений с высокой жизнеспособной плотностью клеток (VCD) может быть количественно определено надежно и эффективно путем расчета площади, охватываемой клетками, и средней площади, занимаемой единственной ячейкой. Использование пороговых значений в отличие от сегментации для идентификации клеток также позволило провести более сложный анализ, такой как эксперименты, в которых одновременно анализировались различные типы клеток в кокультурах. Было обнаружено, что фибробласты NIH/3T3, которые часто колокализуются с макрофагами RAW264.7 в месте заживления ран, растут в фокальной плоскости, отличной от фокальной плоскости макрофагов¹⁰. Соответственно, было запущено несколько алгоритмов порогового значения для определения фона и переднего плана в зависимости от типа анализируемой ячейки, что позволило точно подсчитать два разных типа клеток в одном изображении.

протокол

1. Клеточная культура и получение изображений

1. Культивируйте макрофаги RAW264.7 при 37 °C и 5% CO₂ в модифицированной орлиной среде (DMEM) Dulbecco с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина-стрептомицина, 1,5 г / л бикарбоната натрия и 5 мкМ β-меркаптоэтанола.
   1. Для монокультурной визуализации культивируют клетки RAW264.7 с плотностью 25 000 клеток/^см2 в колбе клеточной культуры объемом 5 мл с 1 мл среды.
2. Культивирование клеток NIH/3T3 при 37 °C и 5% CO₂ в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина¹¹.
3. Для кокультурной визуализации культивируют макрофаги RAW264.7 и фибробласты NIH/3T3 вместе в различных соотношениях, при общей плотности 25 000 клеток/^см2. Используйте кокультурную среду, которая составляет 1 часть среды RAW264.7 (DMEM, дополненная 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицин, 1,5 г / л бикарбоната натрия и 5 мкМ β-меркаптоэтанола) и 1 часть среды NIH / 3T3 (DMEM, дополненная 10% фетальной бычьей сывороткой и 1% пенициллин-стрептомицином).
4. После посева инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO₂ для достижения жизнеспособной плотности клеток 80% клеточного слияния.
5. Изображение ячеек с помощью перевернутого микроскопа, оснащенного 40-кратным объективом. Получите все изображения в оттенках серого и экспортируйте их в необработанный файл '.czi'.
   1. Определите способность алгоритма точно оценивать изображения с диапазоном качеств изображения. Получайте изображения с различными фокусами, создавая как «невыпуклые» изображения (рисунок 2), так и «луковичные» изображения (рисунок 3).
   2. Экспортируйте и конвертируйте изображения ячеек в 8-битный формат изображений tiff (.tiff) с помощью ImageJ с помощью функции «Batch Convert» на необработанных файлах «.czi» перед анализом MATLAB. Сохраните преобразованные изображения в локальной папке и вручную перенесите эти файлы изображений в соответствующую корзину MATLAB.

2. Анализ изображений-монокультура с использованием в основном файла "monoculture.m"

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги были выполнены с помощью MATLAB. Для протокола MATLAB использовались три файла: «process.m» (Файл дополнительного кодирования 1), файл, содержащий алгоритм, «monoculture.m» (Файл дополнительного кодирования 2), файл для запуска для анализа монокультурных изображений и «coculture_modified.m» (Файл дополнительного кодирования 3), файл для запуска для анализа изображений кокультуры.

1. Используйте метод на основе площадей для получения изображений ячеек, показывающих относительные изменения высоты. Вывод изображения для каждого подшага с помощью функции 'imshow()' для каждого подизображения. Скопируйте и вставьте файл изображения для анализа в корзину и введите имя файла в следующей команде. Нажмите выполнить , чтобы запустить программу.
   imread('имя_файла.tiff')
   1. Анализируйте изображения путем «открытия реконструкцией» с последующим «закрытием реконструкцией», используя исходные функции⁸ для увеличения переднего плана от фона. Используйте первую команду для открытия путем реконструкции, а вторую и третью последовательности для закрытия реконструкцией
      'имопен()'
      'имерод()'
      'imreconstruct()'
2. Бинаризация реконструированных изображений до чистых черных и чистых белых пикселей с использованием системы идентификации на основе процентилей. Обратите внимание, что ячейки преобразуются в чистое белое пиксельное значение «255» в этой системе, тогда как фоновые и посторонние (неклеточные) объекты преобразуются в чистое черное пиксельное значение «0».
   1. Отличить ячейки от фона можно с помощью процентильной разницы от «максимального релевантного пикселя», наибольшего значения пикселя, составляющего не менее 0,5% данного изображения.
   2. Анализ и оценка значений пикселей для макрофагов RAW264.7. Если эти значения находятся в пределах 4,5% от максимального релевантного пикселя, пометьте пиксель как сотовый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта команда может быть выполнена с помощью простой инструкции if.
   3. Для изображений, содержащих луковичные профили ячеек, такие как те, которые показаны на рисунке 2, реализуют итеративную процедуру для исправления ошибочной бинаризации в центрах ячеек (называемых «островами»; см. Ниже), следующим образом.
   4. Определите начальное предположение для общего покрытия сотовой связи; 60% было использовано для этого исследования. Обратите внимание, что количество клеток, присутствующих на изображении, должно зависеть от покрытия клеток - поэтому связь между числом клеток и покрытием клеток может быть определена экспериментально. Используя эту связь, определите переменные 'Alpha' и 'kappa'.
      ПРИМЕЧАНИЕ: «Альфа» представляет собой вектор размером 3 x 1, содержащий следующие относительные процентили высоты: процентиль высоты, при котором были идентифицированы ячейки, процентиль высоты, при котором был идентифицирован фон, и процентиль высоты, при котором обычно находились острова-регионы, в которых значения интенсивности были значительно ниже значений ячеек. «Каппа» представляет собой общую площадь, покрытую ячейками на изображении.
   5. Запустите алгоритм, который будет (i) анализировать изображения, используя первоначальные оценки альфа и каппы, чтобы заполнить часть островов, и (ii) использовать количество клеток и покрытие после анализа для пересчета каппы. Если значение каппы находится в пределах 10% от первоначального предположения, переходите к следующему шагу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для изображений, содержащих клетки RAW264.7 и NIH/3T3, альфа оказалась [4.3, 5.5, 10]. Другими словами, разница в 4,3% от максимального релевантного пикселя определяла процентиль высоты, при котором были идентифицированы ячейки, разница в 5,5% от максимального релевантного пикселя определяла процентиль высоты, при котором был идентифицирован фон. Разница в 10% от максимального релевантного пикселя определяла процентиль высоты, на котором обычно находились острова.
3. После бинаризации изображения автоматически определите среднюю площадь ячейки с помощью алгоритма поиска круга с открытым исходным кодом, который выполняет преобразование Хафа на бинаризированном изображении 12,13,14. Используйте следующую команду, чтобы получить вектор всех центральных расположений и радиусов окружностей, найденных в изображении.
   '[центры, радиусы] = imfindcircle(A, [minradius, maxradius])'
   «A» в этой команде — это изображение выбора, а [minradius, maxradius] — диапазон радиусов, которые алгоритм попытается обнаружить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура для определения средней площади клеток предполагает, что морфология клеток макрофагов была как круговой, так и последовательной между клетками¹⁰. Из экспериментальных данных чаще всего наблюдается, что радиусы макрофагов составляют от 30 до 50 пикселей при 40-кратном увеличении. Этот диапазон пикселей определяется как приемлемый диапазон для алгоритма поиска круга. Радиусы могут значительно отличаться для других типов клеток и потребуют определения с использованием экспериментального анализа.
   1. Используйте выходы радиусов для вычисления средней площади ячейки путем усреднения. Проанализируйте не менее 10 клеток, чтобы обеспечить точную идентификацию области.
4. Определите общее количество ячеек в изображении, используя среднюю площадь ячейки.
   1. Просмотрите матрицу изображения и подсчитайте общее количество пикселей ячейки. Определите общий охват ячеек, разделив количество пикселей ячейки на общее количество пикселей в изображении. Определите общее количество ячеек в изображении, разделив количество пикселей ячейки на среднюю площадь ячейки.

3. Анализ изображений-кокультура с использованием в основном файла "coculture_modified.m"

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги были выполнены с помощью MATLAB.

1. Используйте метод на основе площадей для получения изображений ячеек, показывающих относительные изменения высоты. Вывод изображения для каждого подшага с помощью функции 'imshow()' для каждого подизображения. Скопируйте и вставьте файл изображения для анализа в корзину и введите имя файла в следующей команде. Нажмите выполнить , чтобы запустить программу.
   'imread('имя_файла.tiff')'
   1. Анализируйте изображения путем «открытия реконструкцией» с последующим «закрытием реконструкцией», используя исходные функции¹⁰ для увеличения переднего плана с фона. Используйте первую команду для открытия путем реконструкции, а вторую и третью последовательности для закрытия реконструкцией.
      'имопен ()'
      'имерод()'
      'imreconstruct()'
2. Провести анализ кокультур, содержащих клетки RAW264.7 и NIH/3T3, используя две селективные бинаризации, полученные путем использования различий в высоте между двумя типами клеток.
   1. Экспериментально определить параметр «phi», используя изображения клеток RAW264.7 и NIH/3T3, причем phi представляет пропорциональную разницу высот между двумя типами клеток. Угадайте начальное значение phi и итерируйте до тех пор, пока количество клеток и покрытие не будут близко совпадать с ручными подсчетами, характерными для кокультуры RAW264.7 и NIH/3T3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Было установлено, что значение для фи, используемое в этих исследованиях, составляет 3,2. Phi используется для выборочной фильтрации изображения, чтобы оно содержало только ячейки RAW264.7, как показано на рисунке 4C.
   2. Определите количество клеток RAW264.7 и общее покрытие клеток таким же образом, как и для монокультурных изображений.
3. Снова проанализируйте изображение, преобразованное водоразделом, без параметра phi, обнаружив как макрофаги, так и фибробласты. Получение данных фибробластов NIH/3T3 путем селективного вычитания пикселей клеток RAW264.7, полученных с использованием стандартных пороговых значений и методов количественной оценки на основе площади, описанных на этапе 2.
   1. После анализа всего изображения определите общее количество пикселей NIH/3T3, вычитая общее количество пикселей ячейки из числа пикселей RAW264.7. Рассчитайте охват ячеек NIH/3T3 и RAW264.7, разделив на количество пикселей ячейки для каждой строки ячейки общее количество пикселей изображения.

Результаты

Анализ нелюбковых макрофагов RAW264.7 проводили в монокультурных условиях при 25 000 клеток/^см2. Репрезентативные изображения клеточной культуры были взяты и обработаны в MATLAB после преобразования в 8-битный tiff в ImageJ. Выходные данные алгоритма на протяжении всего процесса были записаны ...

Обсуждение

Мы разработали общую зональную процедуру, которая точно и эффективно подсчитывала клетки на основе высоты клеток, что позволяло проводить количественное определение клеток без окрашивания даже в системах кокультуры. Критические шаги для этой процедуры включали реализацию системы от...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL - 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB - 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA