Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
يصف هذا البروتوكول تقنيات التصنيع الدقيق المطلوبة لبناء جهاز التثقيب الكهربائي للميكروفلويديك على رقاقة. يقوم الإعداد التجريبي بإجراء عمليات نقل على مستوى خلية واحدة خاضعة للرقابة في تدفق مستمر ويمكن تمديدها إلى إنتاجية أعلى مع التحكم القائم على السكان. يتم توفير تحليل يوضح القدرة على مراقبة درجة نفاذية غشاء الخلية كهربائيا في الوقت الفعلي.
تعتمد الابتكارات العلاجية الحالية، مثل العلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات المستضدات الوهمية، بشكل كبير على توصيل الجينات بوساطة فيروسية. على الرغم من كفاءة هذه التقنية ، إلا أنها مصحوبة بتكاليف تصنيع عالية ، مما أدى إلى الاهتمام باستخدام طرق بديلة لتوصيل الجينات. التثقيب الكهربائي هو نهج كهروفيزيائي وغير فيروسي لتوصيل الجينات والمواد الخارجية الأخرى داخل الخلايا. عند تطبيق مجال كهربائي ، يسمح غشاء الخلية مؤقتا بالتوصيل الجزيئي إلى الخلية. عادة ، يتم إجراء التثقيب الكهربائي على المقياس الكلي لمعالجة أعداد كبيرة من الخلايا. ومع ذلك ، يتطلب هذا النهج تطويرا مكثفا للبروتوكول التجريبي ، وهو أمر مكلف عند العمل مع أنواع الخلايا الأولية والتي يصعب نقلها. أدى تطوير البروتوكول المطول ، إلى جانب متطلبات الفولتية الكبيرة لتحقيق شدة المجال الكهربائي الكافية لاختراق الخلايا ، إلى تطوير أجهزة التثقيب الكهربائي على نطاق صغير. يتم تصنيع أجهزة التثقيب الكهربائي الدقيقة هذه باستخدام تقنيات التصنيع الدقيق الشائعة وتسمح بتحكم تجريبي أكبر مع إمكانية الحفاظ على قدرات إنتاجية عالية. يعتمد هذا العمل على تقنية التثقيب الكهربائي للموائع الدقيقة القادرة على اكتشاف مستوى نفاذية غشاء الخلية على مستوى خلية واحدة تحت التدفق المستمر. ومع ذلك ، اقتصرت هذه التقنية على 4 خلايا تمت معالجتها في الثانية ، وبالتالي تم اقتراح نهج جديد لزيادة إنتاجية النظام وتقديمه هنا. هذه التقنية الجديدة ، التي يشار إليها باسم التحكم في التغذية المرتدة القائمة على سكان الخلية ، تأخذ في الاعتبار استجابة نفاذية الخلية لمجموعة متنوعة من ظروف نبض التثقيب الكهربائي وتحدد أفضل ظروف نبض التثقيب الكهربائي لنوع الخلية قيد الاختبار. ثم يتم استخدام وضع الإنتاجية الأعلى ، حيث يتم تطبيق هذه النبضة "المثلى" على تعليق الخلية أثناء النقل. يتم عرض خطوات تصنيع الجهاز وإعداد وتشغيل تجارب الموائع الدقيقة وتحليل النتائج بالتفصيل. أخيرا ، يتم عرض تقنية التثقيب الكهربائي الدقيق هذه من خلال تقديم ترميز بلازميد الحمض النووي لبروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) في خلايا HEK293.
تعتمد الابتكارات العلاجية الحالية في البحوث الطبية الحيوية ، مثل العلاج الخلوي CAR-T (الخلايا التائية المهندسة لمستقبلات المستضد الخيمري) والتحرير الجيني باستخدام CRISPR (تسلسلات الحمض النووي المتكررة القصيرة المتباعدة بانتظام / Cas9 ، بشكل كبير على القدرة على توصيل المواد الخارجية بنجاح وكفاءة إلى الفضاء داخل الخلايا1. في علاج CAR-T ، يستخدم المعيار الذهبي لأداء خطوة توصيل الجينات في تصنيع العلاج بالخلايا النواقل الفيروسية2. على الرغم من أن توصيل الجينات بوساطة فيروسية هو طريقة توصيل فعالة ، إلا أن له أيضا العديد من العيوب. وتشمل هذه تكاليف التصنيع ، والسمية الخلوية ، والمناعة ، والطفرات / إمكانية تكوين الورم ، وقيود ال....
ملاحظة: يجب على المستخدمين مراجعة كافة MSDS للمواد والمستلزمات المستخدمة في هذا البروتوكول. يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة في كل خطوة واستخدام تقنية معقمة أثناء التجربة. تناقش الأقسام 1-7 تصنيع الجهاز.
1. تصنيع الجهاز - تصميم القناع
ملاحظة: را?.......
يسلط الشكل 4 الضوء على مبادئ التشغيل وراء اكتشاف نفاذية الغشاء على مستوى الخلية الواحدة لسعة نبضة واحدة. بعد بدء تجربة التثقيب الكهربائي ، تحدد خوارزمية الكشف عن الخلايا عتبة مثالية للكشف عن الخلايا عبر طريقة الكشف القائمة على المنحدر نقطة تلو الأخرى. ثم يراقب النظام باست?.......
تركز المنهجية المقدمة في هذا البروتوكول بشكل أساسي على التصنيع الدقيق لجهاز الموائع الدقيقة الذي يتم دمجه بعد ذلك في إعداد تجريبي متخصص للتثقيب الكهربائي. يشير مصطلح "الوصفة" ، الذي يستخدم غالبا عند وصف تفاصيل عملية التصنيع الدقيق ، إلى أهمية اتباع / تحسين كل خطوة لتصنيع جهاز فعال بنجاح. و?.......
يود المؤلفون الاعتراف بالدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم (NSF CBET 0967598 ، DBI IDBR 1353918) وتدريب الخريجين التابع لوزارة التعليم الأمريكية في المجالات الناشئة للطب الدقيق والشخصي (P200A150131) لتمويل طالب الدراسات العليا JJS على الزمالة.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved