Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
Denne protokol beskriver de mikrofabrikationsteknikker, der kræves for at opbygge en lab-on-a-chip, mikrofluidisk elektroporationsenhed. Den eksperimentelle opsætning udfører kontrollerede transfektioner på enkeltcelleniveau i et kontinuerligt flow og kan udvides til højere gennemløb med populationsbaseret kontrol. Der leveres en analyse, der viser evnen til elektrisk at overvåge graden af cellemembranpermeabilisering i realtid.
Nuværende terapeutiske innovationer, såsom CAR-T-celleterapi, er stærkt afhængige af viral-medieret genlevering. Selvom den er effektiv, ledsages denne teknik af høje produktionsomkostninger, hvilket har skabt interesse for at bruge alternative metoder til genlevering. Elektroporation er en elektrofysisk, ikke-viral tilgang til intracellulær levering af gener og andre eksogene materialer. Ved påføring af et elektrisk felt tillader cellemembranen midlertidigt molekylær levering ind i cellen. Typisk udføres elektroporation på makroskalaen for at behandle et stort antal celler. Denne tilgang kræver imidlertid omfattende empirisk protokoludvikling, hvilket er dyrt, når man arbejder med primære og vanskelige at transficere celletyper. Langvarig protokoludvikling kombineret med kravet om store spændinger for at opnå tilstrækkelige elektriske feltstyrker til at gennemtrænge cellerne har ført til udviklingen af elektroporationsanordninger i mikroskala. Disse mikroelektroporationsanordninger fremstilles ved hjælp af almindelige mikrofabrikationsteknikker og giver mulighed for større eksperimentel kontrol med potentiale til at opretholde høje gennemstrømningsfunktioner. Dette arbejde bygger på en mikrofluidisk elektroporationsteknologi, der er i stand til at detektere niveauet af cellemembranpermeabilisering på et enkeltcelleniveau under kontinuerlig strømning. Denne teknologi var imidlertid begrænset til 4 celler behandlet i sekundet, og derfor foreslås og præsenteres en ny tilgang til at øge systemets gennemstrømning her. Denne nye teknik, betegnet som cellepopulationsbaseret feedbackkontrol, overvejer cellepermeabiliseringsresponsen på en række elektroporationspulserende forhold og bestemmer de bedst egnede elektroporationspulsbetingelser for celletypen under test. Der anvendes derefter en højere gennemstrømningstilstand, hvor denne 'optimale' puls påføres cellesuspensionen under transit. Trinene til fremstilling af enheden, opsætning og kørsel af mikrofluidiske eksperimenter og analyse af resultaterne præsenteres detaljeret. Endelig demonstreres denne mikroelektroporationsteknologi ved at levere et DNA-plasmid, der koder for grønt fluorescerende protein (GFP) i HEK293-celler.
Nuværende terapeutiske innovationer inden for biomedicinsk forskning, såsom CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T-celle) celleterapi og genetisk redigering ved hjælp af CRISPR (grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagne DNA-sekvenser) / Cas9, er stærkt afhængige af evnen til at levere eksogent materiale både med succes og effektivt ind i det intracellulære rum1. I CAR-T-terapi er guldstandarden til at udføre genleveringstrinnet i fremstilling af celleterapi ved hjælp af virale vektorer2. Selvom viral-medieret genlevering er en effektiv leveringsmodalitet, har den også flere ulemper. Disse omf....
BEMÆRK: Brugere bør gennemgå alle MSDS for de materialer og forsyninger, der anvendes i denne protokol. Der skal bæres passende personlige værnemidler på hvert trin, og steril teknik skal anvendes under forsøg. Afsnit 1-7 diskuterer enhedens fabrikation.
1. Enhedsfremstilling - Maskedesign
BEMÆRK: Se figur 2 for en illustration af mikrofabrikationsprocessen. Mikrofabrikationstrinnene skal udføres i et renrumsmilj.......
Figur 4 fremhæver driftsprincipperne bag membranpermeabiliseringsdetektering på enkeltcelleniveau for en enkelt pulsamplitude. Efter initieringen af elektroporationseksperimentet bestemmer celledetekteringsalgoritmen en optimal tærskel for celledetektion via en punkt-for-punkt, hældningsbaseret detektionsmetode. Systemet overvåger derefter kontinuerligt (1) for en signifikant negativ ændring i den målte elektriske strøm, hvilket er tegn på indgangen til en celle. Dette skyldes den b.......
Metoden, der præsenteres inden for denne protokol, fokuserer primært på mikrofabrikation af en mikrofluidisk enhed, der derefter integreres i en specialiseret elektroporationseksperimentel opsætning. Udtrykket 'opskrift', som ofte bruges, når man beskriver detaljerne i mikrofabrikationsprocessen, antyder vigtigheden af at følge / optimere hvert trin for at kunne fremstille en fungerende enhed. Imidlertid kan visse kritiske trin i processen, når de ikke er optimeret, såsom UV-eksponeringstid / energi, PVD-forstøv.......
Forfatterne vil gerne anerkende økonomisk støtte fra National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) og US Department of Education's Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) til finansiering af kandidatstuderende JJS på stipendium.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved