Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
Dit protocol beschrijft de microfabricagetechnieken die nodig zijn om een lab-on-a-chip, microfluïdisch elektroporatieapparaat te bouwen. De experimentele opstelling voert gecontroleerde transfecties op één celniveau uit in een continue stroom en kan worden uitgebreid naar hogere doorvoersnelheden met populatiegebaseerde controle. Er wordt een analyse verstrekt die de mogelijkheid toont om de mate van celmembraanpermeabilisatie in realtime elektrisch te bewaken.
Huidige therapeutische innovaties, zoals CAR-T-celtherapie, zijn sterk afhankelijk van viraal gemedieerde genafgifte. Hoewel efficiënt, gaat deze techniek gepaard met hoge productiekosten, wat heeft geleid tot een interesse in het gebruik van alternatieve methoden voor genafgifte. Elektroporatie is een elektrofysische, niet-virale benadering voor de intracellulaire afgifte van genen en andere exogene materialen. Bij het aanbrengen van een elektrisch veld maakt het celmembraan tijdelijk moleculaire afgifte in de cel mogelijk. Meestal wordt elektroporatie uitgevoerd op de macroschaal om grote aantallen cellen te verwerken. Deze aanpak vereist echter uitgebreide empirische protocolontwikkeling, wat kostbaar is bij het werken met primaire en moeilijk te transfecteren celtypen. Langdurige protocolontwikkeling, in combinatie met de vereiste van grote spanningen om voldoende elektrische veldsterkten te bereiken om de cellen te permeabiliseren, heeft geleid tot de ontwikkeling van elektroporatie-apparaten op microschaal. Deze micro-elektroporatie-apparaten worden vervaardigd met behulp van gangbare microfabricagetechnieken en zorgen voor een grotere experimentele controle met het potentieel om hoge doorvoermogelijkheden te behouden. Dit werk bouwt voort op een microfluïdische elektroporatietechnologie die in staat is om het niveau van celmembraanpermeabilisatie op eencellig niveau onder continue stroom te detecteren. Deze technologie was echter beperkt tot 4 cellen die per seconde werden verwerkt, en daarom wordt hier een nieuwe aanpak voor het verhogen van de systeemdoorvoer voorgesteld en gepresenteerd. Deze nieuwe techniek, aangeduid als celpopulatie-gebaseerde feedbackcontrole, beschouwt de celpermeabilisatierespons op een verscheidenheid aan elektroporatiepulserende omstandigheden en bepaalt de meest geschikte elektroporatiepulsomstandigheden voor het celtype dat wordt getest. Vervolgens wordt een modus met een hogere doorvoer gebruikt, waarbij deze 'optimale' puls wordt toegepast op de celsuspensie tijdens het transport. De stappen voor het fabriceren van het apparaat, het opzetten en uitvoeren van de microfluïdische experimenten en het analyseren van de resultaten worden in detail gepresenteerd. Ten slotte wordt deze micro-elektroporatietechnologie gedemonstreerd door een DNA-plasmide af te leveren dat codeert voor groen fluorescerend eiwit (GFP) in HEK293-cellen.
Huidige therapeutische innovaties in biomedisch onderzoek, zoals CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) celtherapie en genetische bewerking met behulp van CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeat DNA sequences)/Cas9, zijn sterk afhankelijk van het vermogen om exogene stof zowel succesvol als efficiënt in de intracellulaire ruimte af te leveren1. In CAR-T-therapie is de gouden standaard om de genafgiftestap uit te voeren in de productie van celtherapie het gebruik van virale vectoren2. Hoewel viraal-gemedieerde genafgifte een efficiënte leveringsmodaliteit is, heeft het ook verschillende....
OPMERKING: Gebruikers moeten alle VIB's controleren op de materialen en benodigdheden die in dit protocol worden gebruikt. Bij elke stap moeten geschikte PBM's worden gedragen en steriele technieken die tijdens experimenten worden gebruikt. In secties 1-7 wordt de fabricage van het apparaat besproken.
1. Fabricage van het apparaat - Maskerontwerp
OPMERKING: Zie figuur 2 voor een illustratie van het microfabricageproces. D.......
Figuur 4 belicht de werkingsprincipes achter de membraanpermeabilisatiedetectie op één celniveau voor een enkele pulsamplitude. Na de start van het elektroporatie-experiment bepaalt het celdetectiealgoritme een optimale drempel voor celdetectie via een puntsgewijze, op helling gebaseerde detectiemethode. Het systeem controleert vervolgens continu (1) op een significante negatieve verandering in de gemeten elektrische stroom, die indicatief is voor het binnendringen van een cel. Dit komt do.......
De methodologie die in dit protocol wordt gepresenteerd, richt zich voornamelijk op de microfabricage van een microfluïdisch apparaat dat vervolgens wordt geïntegreerd in een gespecialiseerde elektroporatie-experimentele opstelling. De term 'recept', die vaak wordt gebruikt bij het beschrijven van de specifieke kenmerken van het microfabricageproces, wijst op het belang van het volgen / optimaliseren van elke stap om een werkend apparaat met succes te fabriceren. Bepaalde kritieke stappen binnen het proces, wanneer ze .......
De auteurs willen graag financiële steun erkennen van de National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) en de Graduate Training van het Amerikaanse ministerie van Onderwijs in opkomende gebieden van precisie en gepersonaliseerde geneeskunde (P200A150131) voor het financieren van afgestudeerde student J.J.S. op fellowship.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved