La fabrication et l’exploitation d’un système de micro-électroporation à flux continu avec détection de perméabilisation

Ce protocole décrit les techniques de microfabrication requises pour construire un dispositif d’électroporation microfluidique en laboratoire sur puce. La configuration expérimentale effectue des transfections contrôlées au niveau d’une seule cellule dans un flux continu et peut être étendue à des débits plus élevés avec un contrôle basé sur la population. Une analyse est fournie démontrant la capacité de surveiller électriquement le degré de perméabilisation de la membrane cellulaire en temps réel.

Les innovations thérapeutiques actuelles, telles que la thérapie cellulaire CAR-T, dépendent fortement de l’administration de gènes à médiation virale. Bien qu’efficace, cette technique s’accompagne de coûts de fabrication élevés, ce qui a suscité un intérêt pour l’utilisation de méthodes alternatives pour l’administration de gènes. L’électroporation est une approche électrophysique non virale pour la livraison intracellulaire de gènes et d’autres matériaux exogènes. Lors de l’application d’un champ électrique, la membrane cellulaire permet temporairement la livraison moléculaire dans la cellule. En règle générale, l’électroporation est effectuée à l’échelle macroscopique pour traiter un grand nombre de cellules. Cependant, cette approche nécessite un développement de protocole empirique approfondi, ce qui est coûteux lorsque l’on travaille avec des types de cellules primaires et difficiles à transfecter. Le développement de longs protocoles, associé à l’exigence de grandes tensions pour atteindre des intensités de champ électrique suffisantes pour perméabiliser les cellules, a conduit au développement de dispositifs d’électroporation à micro-échelle. Ces dispositifs de micro-électroporation sont fabriqués à l’aide de techniques de microfabrication courantes et permettent un plus grand contrôle expérimental avec le potentiel de maintenir des capacités de débit élevé. Ce travail s’appuie sur une technologie d’électroporation microfluidique capable de détecter le niveau de perméabilisation de la membrane cellulaire au niveau d’une seule cellule en flux continu. Cependant, cette technologie a été limitée à 4 cellules traitées par seconde, et donc une nouvelle approche pour augmenter le débit du système est proposée et présentée ici. Cette nouvelle technique, appelée contrôle par rétroaction basé sur la population cellulaire, considère la réponse de perméabilisation cellulaire à une variété de conditions de pulsations d’électroporation et détermine les conditions d’impulsion d’électroporation les mieux adaptées au type de cellule testé. Un mode à débit plus élevé est ensuite utilisé, où cette impulsion « optimale » est appliquée à la suspension cellulaire en transit. Les étapes de fabrication de l’appareil, de mise en place et d’exécution des expériences microfluidiques et d’analyse des résultats sont présentées en détail. Enfin, cette technologie de micro-électroporation est démontrée en délivrant un plasmide d’ADN codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules HEK293.

Les innovations thérapeutiques actuelles dans la recherche biomédicale, telles que la thérapie cellulaire CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) et l’édition génétique utilisant CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeat DNA sequences)/Cas9, reposent fortement sur la capacité de délivrer du matériel exogène à la fois avec succès et efficacité dans l’espace intracellulaire¹. Dans la thérapie CAR-T, l’étalon-or pour effectuer l’étape de livraison de gènes dans la fabrication de thérapies cellulaires est l’utilisation de vecteurs viraux². Bien que l’administration de gènes à médiation virale....

REMARQUE : Les utilisateurs devraient examiner toutes les FS pour les matériaux et les fournitures utilisés dans ce protocole. L’EPI approprié doit être porté à chaque étape et la technique stérile utilisée pendant l’expérimentation. Les sections 1 à 7 traitent de la fabrication de l’instrument.

1. Fabrication de l’appareil - Conception du masque

REMARQUE : Reportez-vous à la figure 2 pour une illustra.......

La figure 4 met en évidence les principes de fonctionnement de la détection de perméabilisation membranaire au niveau d’une cellule unique pour une amplitude d’impulsion unique. Après le lancement de l’expérience d’électroporation, l’algorithme de détection de cellule détermine un seuil optimal pour la détection de cellules via une méthode de détection point par point, basée sur la pente. Le système surveille ensuite en permanence (1) un changement négatif significati.......

La méthodologie présentée dans ce protocole se concentre principalement sur la microfabrication d’un dispositif microfluidique qui est ensuite intégré dans une installation expérimentale spécialisée en électroporation. Le terme « recette », qui est souvent utilisé pour décrire les spécificités du processus de microfabrication, fait allusion à l’importance de suivre / optimiser chaque étape pour fabriquer avec succès un dispositif fonctionnel. Cependant, certaines étapes critiques du procédé, lors.......

Les auteurs tiennent à remercier la National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) et le programme Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) du département de l’Éducation des États-Unis pour le financement de la bourse J.J.S. de l’étudiant diplômé.