Herstellung und Betrieb eines kontinuierlichen Durchfluss-Mikroelektroporationssystems mit Permeabilisierungsdetektion

Dieses Protokoll beschreibt die Mikrofabrikationstechniken, die erforderlich sind, um ein mikrofluidisches Lab-on-a-Chip-Elektroporationsgerät zu bauen. Der Versuchsaufbau führt kontrollierte Transfektionen auf Einzelzellebene in einem kontinuierlichen Fluss durch und kann mit populationsbasierter Kontrolle auf höhere Durchsätze erweitert werden. Es wird eine Analyse bereitgestellt, die die Fähigkeit zeigt, den Grad der Permeabilisierung der Zellmembran in Echtzeit elektrisch zu überwachen.

Aktuelle therapeutische Innovationen, wie die CAR-T-Zelltherapie, sind stark von der viral-vermittelten Genabgabe abhängig. Obwohl diese Technik effizient ist, geht sie mit hohen Herstellungskosten einher, was zu einem Interesse an der Verwendung alternativer Methoden für die Genlieferung geführt hat. Die Elektroporation ist ein elektrophysikalischer, nicht-viraler Ansatz zur intrazellulären Abgabe von Genen und anderen exogenen Materialien. Bei Anlegen eines elektrischen Feldes ermöglicht die Zellmembran vorübergehend die molekulare Abgabe in die Zelle. Typischerweise wird die Elektroporation auf der Makroskala durchgeführt, um eine große Anzahl von Zellen zu verarbeiten. Dieser Ansatz erfordert jedoch eine umfangreiche empirische Protokollentwicklung, die bei der Arbeit mit primären und schwer zu transfizierenden Zelltypen kostspielig ist. Langwierige Protokollentwicklung, gepaart mit der Anforderung großer Spannungen, um ausreichende elektrische Feldstärken zur Permeabilisierung der Zellen zu erreichen, hat zur Entwicklung von Elektroporationsgeräten im Mikromaßstab geführt. Diese Mikroelektroporationsgeräte werden mit gängigen Mikrofabrikationstechniken hergestellt und ermöglichen eine bessere experimentelle Kontrolle mit dem Potenzial, hohe Durchsatzfähigkeiten aufrechtzuerhalten. Diese Arbeit baut auf einer mikrofluidischen Elektroporationstechnologie auf, die in der Lage ist, den Grad der Zellmembranpermeabilisierung auf Einzelzellebene unter kontinuierlichem Fluss zu detektieren. Diese Technologie war jedoch auf 4 pro Sekunde verarbeitete Zellen beschränkt, so dass hier ein neuer Ansatz zur Erhöhung des Systemdurchsatzes vorgeschlagen und vorgestellt wird. Diese neue Technik, die als zellpopulationsbasierte Rückkopplungskontrolle bezeichnet wird, berücksichtigt die Zellpermeabilisierungsantwort auf eine Vielzahl von Elektroporationspulsbedingungen und bestimmt die am besten geeigneten Elektroporationspulsbedingungen für den zu testenden Zelltyp. Anschließend wird ein Modus mit höherem Durchsatz verwendet, bei dem dieser "optimale" Impuls auf die Zellsuspension während des Transports angewendet wird. Die Schritte zur Herstellung des Geräts, zum Aufbau und zur Durchführung der mikrofluidischen Experimente und zur Analyse der Ergebnisse werden detailliert vorgestellt. Schließlich wird diese Mikroelektroporationstechnologie demonstriert, indem ein DNA-Plasmid, das für grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, in HEK293-Zellen eingebracht wird.

Aktuelle therapeutische Innovationen in der biomedizinischen Forschung, wie die CAR-T-Zelltherapie (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) und die genetische Editierung mittels CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat DNA sequences)/Cas9, hängen stark von der Fähigkeit ab, exogenes Material sowohl erfolgreich als auch effizient in den intrazellulären Raum zu bringen¹. In der CAR-T-Therapie ist der Goldstandard für die Durchführung des Genabgabeschritts bei der Zelltherapieherstellung die Verwendung viraler Vektoren². Obwohl die viral vermittelte Genabgabe eine effiziente Verabreichungsmodali....

HINWEIS: Benutzer sollten alle Sicherheitsdatenblätter auf die in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Verbrauchsmaterialien überprüfen. Bei jedem Schritt und jeder sterilen Technik, die während des Experimentierens verwendet wird, sollte eine geeignete PSA getragen werden. In den Abschnitten 1-7 wird die Geräteherstellung erläutert.

1. Geräteherstellung - Maskendesign

HINWEIS: In Abbildung 2 finden Sie ein.......

Abbildung 4 zeigt die Funktionsprinzipien hinter der Einzelzell-Membranpermeabilisierungsdetektion für eine einzelne Pulsamplitude. Nach Beginn des Elektroporationsexperiments bestimmt der Zelldetektionsalgorithmus eine optimale Schwelle für die Zelldetektion über ein punktweises, steigungsbasiertes Detektionsverfahren. Das System überwacht dann kontinuierlich (1) auf eine signifikante negative Änderung des gemessenen elektrischen Stroms, was auf den Eintritt einer Zelle hinweist. Dies .......

Die in diesem Protokoll vorgestellte Methodik konzentriert sich in erster Linie auf die Mikrofabrikation eines mikrofluidischen Geräts, das dann in einen speziellen Elektroporationsversuchsaufbau integriert wird. Der Begriff "Rezept", der häufig zur Beschreibung der Besonderheiten des Mikrofabrikationsprozesses verwendet wird, deutet darauf hin, wie wichtig es ist, jeden Schritt zu befolgen / zu optimieren, um ein funktionierendes Gerät erfolgreich herzustellen. Bestimmte kritische Schritte innerhalb des Prozesses, we.......

Die Autoren danken der National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) und der Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) des US-Bildungsministeriums für die Finanzierung des Doktoranden J.J.S. auf Stipendium.