JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Bioengineering

ייצור והפעלה של זרימה רציפה, מערכת מיקרו-אלקטרופורציה עם זיהוי חלחול

Published: January 7th, 2022

DOI:

10.3791/63103

1The Department of Biomedical Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey, 2The Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey

פרוטוקול זה מתאר את טכניקות המיקרו-פבריקציה הנדרשות לבניית התקן אלקטרופורציה מיקרופלואידי במעבדה על שבב. מערך הניסוי מבצע טרנספקציות מבוקרות ברמת תא בודד בזרימה רציפה וניתן להרחיב אותן לתפוקות גבוהות יותר עם בקרה מבוססת אוכלוסייה. ניתן ניתוח המציג את היכולת לעקוב באופן חשמלי אחר מידת החדירה של קרום התא בזמן אמת.

החידושים הטיפוליים הנוכחיים, כגון טיפול בתאי CAR-T, מסתמכים במידה רבה על העברת גנים בתיווך ויראלי. למרות יעילותה, טכניקה זו מלווה בעלויות ייצור גבוהות, מה שהביא להתעניינות בשימוש בשיטות חלופיות להעברת גנים. אלקטרופורציה היא גישה אלקטרו-פיזיקלית, לא ויראלית, להעברה תוך-תאית של גנים וחומרים אקסוגניים אחרים. עם יישום שדה חשמלי, קרום התא מאפשר באופן זמני העברה מולקולרית לתוך התא. בדרך כלל, אלקטרופורציה מבוצעת בקנה מידה מאקרו כדי לעבד מספר גדול של תאים. עם זאת, גישה זו דורשת פיתוח פרוטוקול אמפירי נרחב, שהוא יקר כאשר עובדים עם סוגי תאים ראשוניים וקשים להעברה. פיתוח פרוטוקולים ממושך, יחד עם הדרישה למתחים גדולים כדי להשיג עוצמות שדה חשמלי מספיקות כדי לחדור לתאים, הובילו לפיתוח התקני אלקטרופורציה בקנה מידה זעיר. התקני מיקרו-אלקטרופורציה אלה מיוצרים בטכניקות מיקרו-פבריקציה נפוצות ומאפשרים בקרה ניסיונית רבה יותר עם פוטנציאל לשמירה על יכולות תפוקה גבוהות. עבודה זו מתבססת על טכנולוגיה מיקרופלואידית-אלקטרופורציה המסוגלת לזהות את רמת החדירה של קרום התא ברמת תא בודד תחת זרימה רציפה. עם זאת, טכנולוגיה זו הוגבלה ל -4 תאים מעובדים בשנייה, ולכן גישה חדשה להגדלת תפוקת המערכת מוצעת ומוצגת כאן. טכניקה חדשה זו, המסומנת כבקרת משוב מבוססת אוכלוסיית תאים, בוחנת את תגובת חלחול התא למגוון תנאי פעימת אלקטרופורציה וקובעת את תנאי פולס האלקטרופורציה המתאימים ביותר לסוג התא הנבדק. לאחר מכן נעשה שימוש במצב תפוקה גבוהה יותר, שבו הדופק 'האופטימלי' הזה מוחל על השעיית התא במעבר. השלבים לייצור המכשיר, להגדרה ולהפעלה של הניסויים המיקרופלואידיים ולניתוח התוצאות מוצגים בפירוט. לבסוף, טכנולוגיית מיקרו-אלקטרופורציה זו מודגמת על ידי העברת קידוד פלסמיד DNA עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לתאי HEK293.

חידושים טיפוליים עכשוויים במחקר ביו-רפואי, כגון טיפול בתאי CAR-T (קולטן אנטיגן כימרי מהונדס) ועריכה גנטית באמצעות קריספר (רצפי דנ"א חוזרים פלינדרומיים קצרים בין-מרחביים באופן קבוע)/Cas9, מסתמכים במידה רבה על היכולת להעביר חומר אקסוגני הן בהצלחה והן ביעילות לחלל התוך-תאי1. בטיפול CAR-T, תקן הזהב לביצוע שלב העברת הגנים בייצור טיפול תאי הוא שימוש בווקטורים נגיפיים2. למרות שהעברת גנים בתיווך ויראלי היא שיטת העברה יעילה, יש לה גם כמה חסרונות. אלה כוללים עלויות ייצור, ציטוטוקסיות, אימונוגניות, פוטנציאל מוטגנזה/גידול ומגבלות גודל על הגנים שיסופקו3. מגבלות אלה הובילו למחקר ופיתוח של טכנולוגיות אספקה חלופי....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הערה: על המשתמשים לסקור את כל MSDS עבור החומרים והחומרים המתכלים המשמשים בפרוטוקול זה. יש ללבוש PPE מתאים בכל שלב וטכניקה סטרילית המשמשת במהלך הניסוי. סעיפים 1-7 דנים בייצור המכשיר.

1. ייצור מכשירים - עיצוב מסכה

הערה: עיין באיור 2 להמחשה של תה.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

איור 4 מדגיש את עקרונות הפעולה מאחורי זיהוי חלחול הממברנה ברמת התא הבודד עבור משרעת פעימה אחת. לאחר תחילת ניסוי האלקטרופורציה, אלגוריתם זיהוי התאים קובע סף אופטימלי לזיהוי תאים באמצעות שיטת זיהוי מבוססת שיפוע נקודה אחר נקודה. לאחר מכן המערכת מנטרת באופן רציף (1) אחר שינוי ש?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המתודולוגיה המוצגת בפרוטוקול זה מתמקדת בעיקר במיקרו-פבריקציה של התקן מיקרופלואידי המשולב לאחר מכן במערך ניסויי מיוחד של אלקטרופורציה. המונח 'מתכון', המשמש לעתים קרובות כאשר מתארים את הפרטים של תהליך המיקרו-פברייקציה, רומז על החשיבות של מעקב/אופטימיזציה של כל שלב כדי לייצר בהצלחה מכשיר מת.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המחברים רוצים להודות על תמיכה כספית של הקרן הלאומית למדע (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) והכשרת הבוגרים של משרד החינוך האמריקאי בתחומים מתפתחים של דיוק ורפואה מותאמת אישית (P200A150131) למימון הסטודנט לתואר שני J.J.S. על המלגה.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
150-mm diameter petri dishesVWR25384-326step 6.1.1 to secure wafer
24-well tissue culture platesVWR10062-896step 10.3.6 to plate electroporated cells
33220A Waveform/Function generatorAgilentstep 9.2.3 electroporation pulse generator
4'' Si-wafersUniversity Wafersubsection 2.1 for microfluidic channel fabrication
6-well tissue culture platesVWR10062-892step 8.1.8 to plate cells
AcetoneFisher ScientificA18-4step 2.1.2 for cleaning and  step 5.1 photoresist lift-off
Allegra X-22R CentrifugeBeckman Coultersteps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells
AutoCAD 2018Autodesksubsection 1.1. to design transparency masks
Buffered oxide etchant 10:1VWR901621-1Lsubsection 3.1 for HF etching
CCD Monochrome microscope cameraHamamatsuOrca 285 C4742-96-12G04step 11.2.3. for imaging
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MPPCOsubsection 9.3 part of the experimental setup
Conductive EpoxyCircuitWorksCW2400subsection 7.6. for wire attachement
Conical Centrifuge Tubes, 15 mLFisher Scientific14-959-70Cstep 8.1.4. for cell centrifuging
Dektak 3ST Surface ProfilometerVeeco (Sloan/Dektak)step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry
Disposable biopsy punch, 0.75 mmRobbins InstrumentsRBP075step 6.2.3 for inlet access
Disposable biopsy punch, 3 mmRobbins InstrumentsRBP30Pstep 6.2.3 for outlet access
DRAQ5abcamab108410step 11.2.2. for live cell staining
Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumThermoFisher Scientific11885084step 8.1.2. part of media composition
E3631A Bipolar Triple DC power supplyAgilentstep 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup
Eclipse TE2000-U Inverted  MicroscopeNikon subsection 9.3. part of the experimental setup
EVG620 UV Lithography SystemEVG step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure
Fetal Bovine SerumNeuromicsFBS001step 8.1.2. part of media composition
FS20 Ultrasonic CleanerFisher Scientificsubsection 5.1. for photoresist lift-off
Glass Media Bottle with Cap, 100mLFisher ScientificFB800100step 8.2.1. for buffer storage
Glass Media Bottle with Cap, 500mLFisher ScientificFB800500step 8.1.2.for media storage
HEK-293 cell lineATCCCRL-1573subsection 8.1 for cell culturing
HEPES buffer solutionSigma Aldrich83264-100ML-Fstep 8.2.1 part of electroporation buffer composition
HexamethyldisilazaneSigma Aldrich379212-25MLstep 2.2.3 adhesion promoter
HF2LI Lock-in AmplifierZurich Instrumentssubsection 9.2 part of the experimental setup
HF2TA Current amplifierZurich Instrumentssubsection 9.2 part of the experimental setup
Isopropyl AlcoholFisher ScientificA459-1step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS
IX81 fluorescence microscopeOlympusstep 11.2.3 for imaging
L-Glutamine SolutionSigma AldrichG7513-20MLstep 8.1.2. part of media composition
M16878/1BFA 22 gauge wireAWCB22-1subsection 7.5 for device fabrication
Magnesium chlorideSigma Aldrich208337-100Gstep 8.1.2 part of electroporation buffer composition
MF 319 DeveloperKayaku Advanced Materials10018042step 2.2.9. photoresist developer
Microposit S1818 photoresistKayaku Advanced Materials1136925step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning
Microscope slides, 75 x 25 mmVWR16004-422step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate
Model 2350 High voltage amplifierTEGAM2350step 9.2.5. part of the experimental setup
National Instruments LabVIEWNational Instrumentsdata acquisition
Needle, 30G x 1 inBD Scientific305128step 10.1.1. part of the system priming
PA90 IC OPAMP Power circuitDigi-key598-1330-NDPart of the custom circuit
Penicillin-StreptomycinSigma AldrichP4458-20MLstep 8.1.2. part of media composition
Plasmid pMAX-GFPLonzaVCA-1003step 8.3.4. for intracellular delivery
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030"VWR89404-300step 10.1.2. for system priming
Platinum targetsKurt J. Leskersubsection 4.2. for physical vapor deposition
Potassium chlorideSigma AldrichP9333-500Gstep 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pumpHarvard ApparatusMA1 70-2213step 10.1.4. for system priming
PVD75 Physical vapor deposition systemKurt J. Leskersubsection 4.1. for physical vapor deposition
PWM32 Spinner SystemHeadway Researchsteps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist
PX-250 Plasma treatment systemMarch Instrumentssubsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding
SDG1025 Function/Waveform generatorSiglentstep 9.2.2. part of the experimental setup
Sodium hydroxideSigma AldrichS8045-500Gstep 8.2.1. part of electroporation buffer composition
SU-8 2010 negative photoresistKayaku Advanced MaterialsY111053step 2.1.7. for microfluidic channel patterning
SU-8 developerMicrochemY010200step 2.1.12. for photoresist developing
SucroseSigma AldrichS7903-1KGstep 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Sylgard 184 elastomer kitDow Corning3097358-1004step 6.2.1  10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent
Syringe, 1 mlBD Scientific309628step 8.3.4. part of system priming
SZ61 Stereomicroscope SystemOlympussubsection 7.3. for channel and electrode alignment
Tissue Culture Treated T25 FlasksFalcon353108step 8.1.2 for cell culturing
Titanium targetsKurt J. Leskersubsection 4.2. for physical vapor deposition
Transparency masksCAD/ART Servicessteps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneSigma Aldrich448931-10Gstep 6.1.2. for wafer silanization
Trypsin-EDTA solutionSigma AldrichT4049-100MLsteps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting

  1. Gao, Q. Q., et al. Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy. Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).
  2. Aijaz, A., et al. Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).
  3. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).
  4. Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41 (2), 135-160 (1996).
  5. Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models. Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).
  6. Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. Gene electrotransfer: A mechanistic perspective. Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).
  7. Clauss, J., et al. Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors. Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).
  8. Sherba, J. J., et al. The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency. Scientific Reports. 10 (1), 3053 (2020).
  9. Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. A microfluidic electroporation device for cell lysis. Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).
  10. Kar, S., et al. Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects. Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).
  11. Shi, J. F., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  12. Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells. Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).
  13. Wei, W. J., et al. An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo. Microsystems & Nanoengineering. 1, (2015).
  14. Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
  15. Wu, Q. R., et al. Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects. Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).
  16. Pandey, C. M., et al. Microfluidics Based Point-of-Care Diagnostics. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
  17. Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).
  18. Nuxoll, E. BioMEMS in drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1611-1625 (2013).
  19. Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode. Scientific Reports. 5, (2015).
  20. Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).
  21. Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G. Nano-localized single-cell nano-electroporation. Lab on a Chip. 20 (22), 4194-4204 (2020).
  22. Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).
  23. Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation. Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).
  24. Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).
  25. Hsi, P., et al. Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing. Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).
  26. Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control. Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).
  27. Ye, Y. F., et al. Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip. 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).
  28. Huang, Y., Rubinsky, B. Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization. Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).
  29. Guo, X. L., Zhu, R. Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array. Scientific Reports. 6, (2016).
  30. Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation. Scientific Reports. 9, (2019).
  31. Wang, H. Y., Lu, C. Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply. Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).
  32. Zheng, M. D., et al. Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation. Technology. 5 (1), 31-41 (2017).
  33. Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. In vitro electroporation detection methods - An overview. Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).
  34. MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf (2021)
  35. SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf (2001)
  36. Substrate Preparation. MicroChemicals Available from: https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf (2021)
  37. Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. . 4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture. , 91-94 (2006).
  38. Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules. Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).
  39. PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX Available from: https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf (2021)
  40. Lissandrello, C. A., et al. High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing. Scientific Reports. 10 (1), 18045 (2020).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved