JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Bioengineering

परमेबिलाइजेशन डिटेक्शन के साथ एक निरंतर प्रवाह, माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन सिस्टम का निर्माण और संचालन

Published: January 7th, 2022

DOI:

10.3791/63103

1The Department of Biomedical Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey, 2The Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers, The State University of New Jersey

यह प्रोटोकॉल लैब-ऑन-ए-चिप, माइक्रोफ्लुइडिक इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस बनाने के लिए आवश्यक माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों का वर्णन करता है। प्रायोगिक सेटअप एक निरंतर प्रवाह में नियंत्रित, एकल-सेल-स्तरीय अभिकर्मक करता है और इसे जनसंख्या-आधारित नियंत्रण के साथ उच्च थ्रूपुट तक बढ़ाया जा सकता है। वास्तविक समय में कोशिका झिल्ली परमेबिलाइजेशन की डिग्री की विद्युत रूप से निगरानी करने की क्षमता का प्रदर्शन करते हुए एक विश्लेषण प्रदान किया जाता है।

वर्तमान चिकित्सीय नवाचार, जैसे कि सीएआर-टी सेल थेरेपी, वायरल-मध्यस्थता जीन वितरण पर बहुत अधिक निर्भर हैं। हालांकि कुशल, यह तकनीक उच्च विनिर्माण लागत के साथ है, जिसने जीन वितरण के लिए वैकल्पिक तरीकों का उपयोग करने में रुचि लाई है। इलेक्ट्रोपोरेशन जीन और अन्य बहिर्जात सामग्रियों के इंट्रासेल्युलर वितरण के लिए एक इलेक्ट्रो-भौतिक, गैर-वायरल दृष्टिकोण है। एक विद्युत क्षेत्र के आवेदन पर, कोशिका झिल्ली अस्थायी रूप से कोशिका में आणविक वितरण की अनुमति देती है। आमतौर पर, बड़ी संख्या में कोशिकाओं को संसाधित करने के लिए मैक्रोस्केल पर इलेक्ट्रोपोरेशन किया जाता है। हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए व्यापक अनुभवजन्य प्रोटोकॉल विकास की आवश्यकता होती है, जो प्राथमिक और मुश्किल-से-ट्रांसक्रिप्ट सेल प्रकारों के साथ काम करते समय महंगा है। लंबे प्रोटोकॉल विकास, कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए पर्याप्त विद्युत-क्षेत्र शक्तियों को प्राप्त करने के लिए बड़े वोल्टेज की आवश्यकता के साथ मिलकर, माइक्रो-स्केल इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरणों के विकास का नेतृत्व किया है। इन सूक्ष्म-इलेक्ट्रोपोरेशन उपकरणों को सामान्य माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों का उपयोग करके निर्मित किया जाता है और उच्च थ्रूपुट क्षमताओं को बनाए रखने की क्षमता के साथ अधिक प्रयोगात्मक नियंत्रण की अनुमति देता है। यह काम एक माइक्रोफ्लुइडिक-इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक का निर्माण करता है जो निरंतर प्रवाह के तहत एकल-कोशिका स्तर पर कोशिका झिल्ली पारगम्यता के स्तर का पता लगाने में सक्षम है। हालांकि, यह तकनीक प्रति सेकंड संसाधित 4 कोशिकाओं तक सीमित थी, और इस प्रकार सिस्टम थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए एक नया दृष्टिकोण प्रस्तावित और यहां प्रस्तुत किया गया है। सेल-जनसंख्या-आधारित प्रतिक्रिया नियंत्रण के रूप में निरूपित यह नई तकनीक, विभिन्न प्रकार की इलेक्ट्रोपोरेशन स्पंदन स्थितियों के लिए सेल परमेबिलाइजेशन प्रतिक्रिया पर विचार करती है और परीक्षण के तहत सेल प्रकार के लिए सबसे उपयुक्त इलेक्ट्रोपोरेशन पल्स स्थितियों को निर्धारित करती है। एक उच्च-थ्रूपुट मोड का उपयोग किया जाता है, जहां इस 'इष्टतम' पल्स को पारगमन में सेल निलंबन पर लागू किया जाता है। डिवाइस को बनाने, माइक्रोफ्लुइडिक प्रयोगों को स्थापित करने और चलाने और परिणामों का विश्लेषण करने के चरणों को विस्तार से प्रस्तुत किया गया है। अंत में, इस माइक्रो-इलेक्ट्रोपोरेशन तकनीक को हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के लिए एचईके 293 कोशिकाओं में डीएनए प्लास्मिड एन्कोडिंग प्रदान करके प्रदर्शित किया जाता है।

बायोमेडिकल अनुसंधान में वर्तमान चिकित्सीय नवाचार, जैसे कि सीएआर-टी (चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर इंजीनियर्ड टी सेल) सेल थेरेपी और सीआरआईएसपीआर (क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट डीएनए अनुक्रमों) / सीएएस 9 का उपयोग करके आनुवंशिक संपादन, इंट्रासेल्युलर स्पेस1 में बहिर्जात सामग्री को सफलतापूर्वक और कुशलता से वितरित करने की क्षमता पर बहुत अधिक निर्भर करता है। सीएआर-टी थेरेपी में, सेल थेरेपी निर्माण में जीन वितरण चरण करने के लिए स्वर्ण मानक वायरल वैक्टर2 का उपयोग कर रहा है। हालांकि वायरल-मध्यस्थता जीन वितरण एक कुशल वितरण पद्धति है, लेकिन इसमें कई कमियां भी हैं। इनमें विनिर्माण लागत, साइटोटॉक्सिसिटी, इम्युन....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

नोट: उपयोगकर्ताओं को इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सामग्रियों और आपूर्ति के लिए सभी एमएसडीएस की समीक्षा करनी चाहिए। प्रत्येक चरण में उपयुक्त पीपीई पहना जाना चाहिए और प्रयोग के दौरान बाँझ तकनीक ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

चित्रा 4 एकल पल्स आयाम के लिए एकल-कोशिका-स्तरीय झिल्ली परमेबिलाइजेशन डिटेक्शन के पीछे ऑपरेटिंग सिद्धांतों पर प्रकाश डालता है। इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोग की शुरुआत के बाद, सेल डिटेक्शन एल्गोर.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

इस प्रोटोकॉल के भीतर प्रस्तुत पद्धति मुख्य रूप से एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के माइक्रोफैब्रिकेशन पर केंद्रित है जिसे बाद में एक विशेष इलेक्ट्रोपोरेशन प्रयोगात्मक सेटअप में एकीकृत किया जाता है। शब?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

लेखक नेशनल साइंस फाउंडेशन (एनएसएफ सीबीईटी 0967598, डीबीआई आईडीबीआर 1353918) और यूएस डिपार्टमेंट ऑफ एजुकेशन के ग्रेजुएट ट्रेनिंग इन इमर्जिंग एरियाज प्रिसिजन एंड पर्सनलाइज्ड मेडिसिन (पी 200 ए 150131) द्वारा फेलोशिप पर स्नातक छात्र जेजेएस को वित्त पोषित करने के लिए वित्तीय सहायता को स्वीकार करना चाहते हैं।

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
150-mm diameter petri dishesVWR25384-326step 6.1.1 to secure wafer
24-well tissue culture platesVWR10062-896step 10.3.6 to plate electroporated cells
33220A Waveform/Function generatorAgilentstep 9.2.3 electroporation pulse generator
4'' Si-wafersUniversity Wafersubsection 2.1 for microfluidic channel fabrication
6-well tissue culture platesVWR10062-892step 8.1.8 to plate cells
AcetoneFisher ScientificA18-4step 2.1.2 for cleaning and  step 5.1 photoresist lift-off
Allegra X-22R CentrifugeBeckman Coultersteps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells
AutoCAD 2018Autodesksubsection 1.1. to design transparency masks
Buffered oxide etchant 10:1VWR901621-1Lsubsection 3.1 for HF etching
CCD Monochrome microscope cameraHamamatsuOrca 285 C4742-96-12G04step 11.2.3. for imaging
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MPPCOsubsection 9.3 part of the experimental setup
Conductive EpoxyCircuitWorksCW2400subsection 7.6. for wire attachement
Conical Centrifuge Tubes, 15 mLFisher Scientific14-959-70Cstep 8.1.4. for cell centrifuging
Dektak 3ST Surface ProfilometerVeeco (Sloan/Dektak)step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry
Disposable biopsy punch, 0.75 mmRobbins InstrumentsRBP075step 6.2.3 for inlet access
Disposable biopsy punch, 3 mmRobbins InstrumentsRBP30Pstep 6.2.3 for outlet access
DRAQ5abcamab108410step 11.2.2. for live cell staining
Dulbecco’s Modified Eagle’s MediumThermoFisher Scientific11885084step 8.1.2. part of media composition
E3631A Bipolar Triple DC power supplyAgilentstep 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup
Eclipse TE2000-U Inverted  MicroscopeNikon subsection 9.3. part of the experimental setup
EVG620 UV Lithography SystemEVG step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure
Fetal Bovine SerumNeuromicsFBS001step 8.1.2. part of media composition
FS20 Ultrasonic CleanerFisher Scientificsubsection 5.1. for photoresist lift-off
Glass Media Bottle with Cap, 100mLFisher ScientificFB800100step 8.2.1. for buffer storage
Glass Media Bottle with Cap, 500mLFisher ScientificFB800500step 8.1.2.for media storage
HEK-293 cell lineATCCCRL-1573subsection 8.1 for cell culturing
HEPES buffer solutionSigma Aldrich83264-100ML-Fstep 8.2.1 part of electroporation buffer composition
HexamethyldisilazaneSigma Aldrich379212-25MLstep 2.2.3 adhesion promoter
HF2LI Lock-in AmplifierZurich Instrumentssubsection 9.2 part of the experimental setup
HF2TA Current amplifierZurich Instrumentssubsection 9.2 part of the experimental setup
Isopropyl AlcoholFisher ScientificA459-1step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS
IX81 fluorescence microscopeOlympusstep 11.2.3 for imaging
L-Glutamine SolutionSigma AldrichG7513-20MLstep 8.1.2. part of media composition
M16878/1BFA 22 gauge wireAWCB22-1subsection 7.5 for device fabrication
Magnesium chlorideSigma Aldrich208337-100Gstep 8.1.2 part of electroporation buffer composition
MF 319 DeveloperKayaku Advanced Materials10018042step 2.2.9. photoresist developer
Microposit S1818 photoresistKayaku Advanced Materials1136925step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning
Microscope slides, 75 x 25 mmVWR16004-422step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate
Model 2350 High voltage amplifierTEGAM2350step 9.2.5. part of the experimental setup
National Instruments LabVIEWNational Instrumentsdata acquisition
Needle, 30G x 1 inBD Scientific305128step 10.1.1. part of the system priming
PA90 IC OPAMP Power circuitDigi-key598-1330-NDPart of the custom circuit
Penicillin-StreptomycinSigma AldrichP4458-20MLstep 8.1.2. part of media composition
Plasmid pMAX-GFPLonzaVCA-1003step 8.3.4. for intracellular delivery
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030"VWR89404-300step 10.1.2. for system priming
Platinum targetsKurt J. Leskersubsection 4.2. for physical vapor deposition
Potassium chlorideSigma AldrichP9333-500Gstep 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pumpHarvard ApparatusMA1 70-2213step 10.1.4. for system priming
PVD75 Physical vapor deposition systemKurt J. Leskersubsection 4.1. for physical vapor deposition
PWM32 Spinner SystemHeadway Researchsteps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist
PX-250 Plasma treatment systemMarch Instrumentssubsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding
SDG1025 Function/Waveform generatorSiglentstep 9.2.2. part of the experimental setup
Sodium hydroxideSigma AldrichS8045-500Gstep 8.2.1. part of electroporation buffer composition
SU-8 2010 negative photoresistKayaku Advanced MaterialsY111053step 2.1.7. for microfluidic channel patterning
SU-8 developerMicrochemY010200step 2.1.12. for photoresist developing
SucroseSigma AldrichS7903-1KGstep 8.2.1. part of electroporation buffer composition
Sylgard 184 elastomer kitDow Corning3097358-1004step 6.2.1  10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent
Syringe, 1 mlBD Scientific309628step 8.3.4. part of system priming
SZ61 Stereomicroscope SystemOlympussubsection 7.3. for channel and electrode alignment
Tissue Culture Treated T25 FlasksFalcon353108step 8.1.2 for cell culturing
Titanium targetsKurt J. Leskersubsection 4.2. for physical vapor deposition
Transparency masksCAD/ART Servicessteps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silaneSigma Aldrich448931-10Gstep 6.1.2. for wafer silanization
Trypsin-EDTA solutionSigma AldrichT4049-100MLsteps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting

  1. Gao, Q. Q., et al. Therapeutic potential of CRISPR/Cas9 gene editing in engineered T-cell therapy. Cancer Medicine. 8 (9), 4254-4264 (2019).
  2. Aijaz, A., et al. Biomanufacturing for clinically advanced cell therapies. Nature Biomedical Engineering. 2 (6), 362-376 (2018).
  3. Milone, M. C., O'Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).
  4. Weaver, J. C., Chizmadzhev, Y. A. Theory of electroporation: A review. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 41 (2), 135-160 (1996).
  5. Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavcic, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: mechanisms and models. Annual Review of Biophysics. 48, 63-91 (2019).
  6. Rosazza, C., Meglic, S. H., Zumbusch, A., Rols, M. P., Miklavcic, D. Gene electrotransfer: A mechanistic perspective. Current Gene Therapy. 16 (2), 98-129 (2016).
  7. Clauss, J., et al. Efficient non-viral T-cell engineering by sleeping beauty minicircles diminishing DNA toxicity and miRNAs silencing the endogenous T-cell receptors. Human Gene Therapy. 29 (5), 569-584 (2018).
  8. Sherba, J. J., et al. The effects of electroporation buffer composition on cell viability and electro-transfection efficiency. Scientific Reports. 10 (1), 3053 (2020).
  9. Lu, H., Schmidt, M. A., Jensen, K. F. A microfluidic electroporation device for cell lysis. Lab on a Chip. 5 (1), 23-29 (2005).
  10. Kar, S., et al. Single-cell electroporation: current trends, applications and future prospects. Journal of Micromechanics and Microengineering. 28 (12), (2018).
  11. Shi, J. F., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  12. Wang, S. N., Zhang, X. L., Wang, W. X., Lee, L. J. Semicontinuous flow electroporation chip for high-throughput transfection on mammalian cells. Analytical Chemistry. 81 (11), 4414-4421 (2009).
  13. Wei, W. J., et al. An implantable microelectrode array for simultaneous L-glutamate and electrophysiological recordings in vivo. Microsystems & Nanoengineering. 1, (2015).
  14. Maschietto, M., Dal Maschio, M., Girardi, S., Vassanelli, S. In situ electroporation of mammalian cells through SiO2 thin film capacitive microelectrodes. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
  15. Wu, Q. R., et al. Organ-on-a-chip: recent breakthroughs and future prospects. Biomedical Engineering Online. 19 (1), (2020).
  16. Pandey, C. M., et al. Microfluidics Based Point-of-Care Diagnostics. Biotechnology Journal. 13 (1), (2018).
  17. Vigneshvar, S., Sudhakumari, C. C., Senthilkumaran, B., Prakash, H. Recent advances in biosensor technology for potential applications - An overview. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, (2016).
  18. Nuxoll, E. BioMEMS in drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1611-1625 (2013).
  19. Kang, S., Kim, K. H., Kim, Y. C. A novel electroporation system for efficient molecular delivery into Chlamydomonas reinhardtii with a 3-dimensional microelectrode. Scientific Reports. 5, (2015).
  20. Zheng, M. D., Shan, J. W., Lin, H., Shreiber, D. I., Zahn, J. D. Hydrodynamically controlled cell rotation in an electroporation microchip to circumferentially deliver molecules into single cells. Microfluidics and Nanofluidics. 20 (1), (2016).
  21. Santra, T. S., Kar, S., Chang, H. Y., Tseng, F. G. Nano-localized single-cell nano-electroporation. Lab on a Chip. 20 (22), 4194-4204 (2020).
  22. Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications. Integrative Biology. 1 (3), 242-251 (2009).
  23. Santra, T. S., Chang, H. Y., Wang, P. C., Tseng, F. G. Impact of pulse duration on localized single-cell nano-electroporation. Analyst. 139 (23), 6249-6258 (2014).
  24. Geng, T., Lu, C. Microfluidic electroporation for cellular analysis and delivery. Lab on a Chip. 13 (19), 3803-3821 (2013).
  25. Hsi, P., et al. Acoustophoretic rapid media exchange and continuous-flow electrotransfection of primary human T cells for applications in automated cellular therapy manufacturing. Lab on a Chip. 19 (18), 2978-2992 (2019).
  26. Khine, M., Ionescu-Zanetti, C., Blatz, A., Wang, L. P., Lee, L. P. Single-cell electroporation arrays with real-time monitoring and feedback control. Lab on a Chip. 7 (4), 457-462 (2007).
  27. Ye, Y. F., et al. Single-cell electroporation and real-time electrical monitoring on a microfluidic chip. 2020 33rd Ieee International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (Mems 2020). , 1040-1043 (2020).
  28. Huang, Y., Rubinsky, B. Microfabricated electroporation chip for single cell membrane permeabilization. Sensors and Actuators a-Physical. 89 (3), 242-249 (2001).
  29. Guo, X. L., Zhu, R. Controllable in-situ cell electroporation with cell positioning and impedance monitoring using micro electrode array. Scientific Reports. 6, (2016).
  30. Punjiya, M., Nejad, H. R., Mathews, J., Levin, M., Sonkusale, S. A flow through device for simultaneous dielectrophoretic cell trapping and AC electroporation. Scientific Reports. 9, (2019).
  31. Wang, H. Y., Lu, C. Microfluidic electroporation for delivery of small molecules and genes into cells using a common DC power supply. Biotechnology and Bioengineering. 100 (3), 579-586 (2008).
  32. Zheng, M. D., et al. Continuous-flow, electrically-triggered, single cell-level electroporation. Technology. 5 (1), 31-41 (2017).
  33. Batista Napotnik, T., Miklavcic, D. In vitro electroporation detection methods - An overview. Bioelectrochemistry. 120, 166-182 (2018).
  34. MICROPOSIT™ S1800® G2 Series Photoresists. KAYAKU Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2019/09/S1800-G2.pdf (2021)
  35. SU-8 2000 Permanent Negative Epoxy Photoresist. KAYAKU Available from: https://kayakuam.com/wp-content/uploads/2020/08/KAM-SU-8-2000-2000.5-2015-Datasheet-8.13.20-final.pdf (2001)
  36. Substrate Preparation. MicroChemicals Available from: https://www.microchemicals.com/technical_information/subtrate_cleaning_adhesion_photoresist.pdf (2021)
  37. Lisinenkova, M., Hahn, L., Schulz, J. . 4M 2006 - Second International Conference on Multi-Material Micro Manufacture. , 91-94 (2006).
  38. Beh, C. W., Zhou, W. Z., Wang, T. H. PDMS-glass bonding using grafted polymeric adhesive - alternative process flow for compatibility with patterned biological molecules. Lab on a Chip. 12 (20), 4120-4127 (2012).
  39. PA90 High Voltage Power Operational Amplifiers. APEX Available from: https://www.apexanalog.com/resources/products/pa90u.pdf (2021)
  40. Lissandrello, C. A., et al. High-throughput continuous-flow microfluidic electroporation of mRNA into primary human T cells for applications in cellular therapy manufacturing. Scientific Reports. 10 (1), 18045 (2020).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved