La fabbricazione e il funzionamento di un sistema di micro-elettroporazione a flusso continuo con rilevamento di permeabilizzazione

Questo protocollo descrive le tecniche di microfabbricazione necessarie per costruire un dispositivo di elettroporazione microfluidica lab-on-a-chip. La configurazione sperimentale esegue trasfezioni controllate a livello di singola cellula in un flusso continuo e può essere estesa a portate più elevate con controllo basato sulla popolazione. Viene fornita un'analisi che mostra la capacità di monitorare elettricamente il grado di permeabilizzazione della membrana cellulare in tempo reale.

Le attuali innovazioni terapeutiche, come la terapia cellulare CAR-T, dipendono fortemente dalla somministrazione genica mediata da virus. Sebbene efficiente, questa tecnica è accompagnata da elevati costi di produzione, che hanno suscitato un interesse nell'utilizzo di metodi alternativi per la consegna genica. L'elettroporazione è un approccio elettrofisico non virale per la consegna intracellulare di geni e altri materiali esogeni. Dopo l'applicazione di un campo elettrico, la membrana cellulare consente temporaneamente la consegna molecolare nella cellula. Tipicamente, l'elettroporazione viene eseguita su macroscala per elaborare un gran numero di cellule. Tuttavia, questo approccio richiede un ampio sviluppo di protocolli empirici, che è costoso quando si lavora con tipi di cellule primarie e difficili da trasfettare. Il lungo sviluppo del protocollo, insieme alla necessità di grandi tensioni per ottenere sufficienti intensità di campo elettrico per permeabilizzare le celle, ha portato allo sviluppo di dispositivi di elettroporazione su microscala. Questi dispositivi di micro-elettroporazione sono fabbricati utilizzando tecniche di microfabbricazione comuni e consentono un maggiore controllo sperimentale con il potenziale di mantenere elevate capacità di produttività. Questo lavoro si basa su una tecnologia di elettroporazione microfluidica in grado di rilevare il livello di permeabilizzazione della membrana cellulare a livello di singola cellula in un flusso continuo. Tuttavia, questa tecnologia è stata limitata a 4 celle elaborate al secondo, e quindi un nuovo approccio per aumentare il throughput del sistema è proposto e presentato qui. Questa nuova tecnica, indicata come controllo di feedback basato sulla popolazione cellulare, considera la risposta di permeabilizzazione cellulare a una varietà di condizioni di impulso dell'elettroporazione e determina le condizioni di impulso di elettroporazione più adatte per il tipo di cellula in esame. Viene quindi utilizzata una modalità a throughput più elevato, in cui questo impulso "ottimale" viene applicato alla sospensione cellulare in transito. I passaggi per fabbricare il dispositivo, impostare e gestire gli esperimenti microfluidici e analizzare i risultati sono presentati in dettaglio. Infine, questa tecnologia di micro-elettroporazione è dimostrata fornendo un plasmide del DNA che codifica per la proteina fluorescente verde (GFP) nelle cellule HEK293.

Le attuali innovazioni terapeutiche nella ricerca biomedica, come la terapia cellulare CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) e l'editing genetico utilizzando CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat DNA sequences) / Cas9, si basano fortemente sulla capacità di fornire materiale esogeno sia con successo che in modo efficiente nello spazio intracellulare¹. Nella terapia CAR-T, il gold standard per eseguire la fase di consegna genica nella produzione di terapia cellulare è l'utilizzo di vettori virali². Sebbene la consegna genica mediata da virus sia una modalità di consegna efficiente,....

NOTA: gli utenti devono esaminare tutte le schede di sicurezza per i materiali e i materiali di consumo utilizzati in questo protocollo. In ogni fase devono essere indossati DPI appropriati e durante la sperimentazione deve essere utilizzata una tecnica sterile. Le sezioni 1-7 illustrano la fabbricazione del dispositivo.

1. Fabbricazione del dispositivo - Design della maschera

NOTA: Fare riferimento alla Figura 2 per un'i.......

La figura 4 evidenzia i principi operativi alla base del rilevamento della permeabilizzazione della membrana a livello di singola cellula per un'ampiezza di impulso singolo. Dopo l'avvio dell'esperimento di elettroporazione, l'algoritmo di rilevamento cellulare determina una soglia ottimale per il rilevamento delle cellule tramite un metodo di rilevamento punto per punto, basato sulla pendenza. Il sistema monitora quindi continuamente (1) una variazione negativa significativa della corrente .......

La metodologia presentata all'interno di questo protocollo si concentra principalmente sulla microfabbricazione di un dispositivo microfluidico che viene poi integrato in una configurazione sperimentale di elettroporazione specializzata. Il termine "ricetta", che viene spesso utilizzato quando si descrivono le specifiche del processo di microfabbricazione, suggerisce l'importanza di seguire / ottimizzare ogni fase per fabbricare con successo un dispositivo funzionante. Tuttavia, alcune fasi critiche all'interno del proce.......

Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno finanziario della National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) e della formazione universitaria del Dipartimento dell'Istruzione degli Stati Uniti in aree emergenti di precisione e medicina personalizzata (P200A150131) per finanziare lo studente laureato J.J.S. sulla borsa di studio.