Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
이 프로토콜은 랩온어칩, 마이크로유체 전기천공 장치를 구축하는 데 필요한 미세 가공 기술을 설명합니다. 실험 설정은 연속 흐름에서 제어된 단일 세포 수준 형질주입을 수행하며 집단 기반 제어를 통해 더 높은 처리량으로 확장할 수 있습니다. 세포막 투과 정도를 실시간으로 전기적으로 모니터링하는 기능을 보여주는 분석이 제공됩니다.
CAR-T 세포 요법과 같은 현재의 치료 혁신은 바이러스 매개 유전자 전달에 크게 의존하고 있습니다. 이 기술은 효율적이지만 높은 제조 비용을 수반하여 유전자 전달을 위한 대체 방법을 사용하는 데 관심을 갖게 되었습니다. 전기 천공은 유전자 및 기타 외인성 물질의 세포 내 전달을위한 전기 물리적, 비 바이러스 적 접근법입니다. 전기장을 인가하면 세포막이 일시적으로 세포 내로 분자 전달을 허용합니다. 일반적으로 전기 천공은 많은 수의 세포를 처리하기 위해 대규모로 수행됩니다. 그러나 이러한 접근 방식에는 광범위한 경험적 프로토콜 개발이 필요하며, 이는 1차 및 형질주입하기 어려운 세포 유형으로 작업할 때 비용이 많이 듭니다. 세포를 투과시키기에 충분한 전기장 강도를 달성하기 위해 큰 전압의 요구 사항과 결합 된 긴 프로토콜 개발은 마이크로 스케일 전기 천공 장치의 개발로 이어졌습니다. 이러한 미세 전기 천공 장치는 일반적인 미세 가공 기술을 사용하여 제조되며 높은 처리량 기능을 유지할 수있는 잠재력으로 더 큰 실험 제어를 허용합니다. 이 작업은 연속 흐름 하에서 단일 세포 수준에서 세포막 투과 수준을 감지 할 수있는 미세 유체 전기 천공 기술을 기반으로합니다. 그러나 이 기술은 초당 처리되는 4개의 셀로 제한되었으므로 시스템 처리량을 늘리기 위한 새로운 접근 방식이 제안되고 여기에 제시됩니다. 세포 집단 기반 피드백 제어로 표시되는이 새로운 기술은 다양한 전기 천공 펄스 조건에 대한 세포 투과 반응을 고려하고 테스트중인 세포 유형에 가장 적합한 전기 천공 펄스 조건을 결정합니다. 그런 다음 더 높은 처리량 모드가 사용되며, 여기서 이 '최적의' 펄스가 이동 중인 세포 현탁액에 적용됩니다. 장치를 제작하고, 미세유체 실험을 설정 및 실행하고, 결과를 분석하는 단계가 자세히 제시됩니다. 마지막으로, 이 미세 전기천공 기술은 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 DNA 플라스미드를 HEK293 세포에 전달함으로써 입증됩니다.
CAR-T(키메라 항원 수용체 조작 T 세포) 세포 치료 및 CRISPR(클러스터링된 규칙적인 간격의 짧은 회문 반복 DNA 서열)/Cas9를 사용한 유전자 편집과 같은 생물의학 연구의 현재 치료 혁신은 외인성 물질을 세포 내 공간1에 성공적이고 효율적으로 전달하는 능력에 크게 의존합니다. CAR-T 요법에서, 세포 치료제 제조에서 유전자 전달 단계를 수행하기 위한 황금 표준은 바이러스 벡터2를 사용하는 것이다. 바이러스 매개 유전자 전달은 효율적인 전달 방식이지만 몇 가지 단점도 있습니다. 여기에는 제조 비용, 세포 독성, 면역원성, 돌연변이 유발/종양 발생 가능성및 전달될 유전자의 크기 제한이 포함됩니다3. 이러한 한계로 인해 대체 비 바이러스 전달 기술의 연구 개발이 이루어졌습니다.
바이러스 매개 유전자 전달의 대안인 전기천공은 세포의 DNA, RNA 및 단백질 형질감염을 수행하기 위해 최적의 전기 펄스 파형의 적용에 의존합니다. 외부 전기장의 인가 후, 세포막이 잠시 손상되어, 세포가 불침투성 외인성 물질4의 세포내 전달에 취약하게 된다. 바이러스 매개 전달에 비해 ....
그림 4는 단일 펄스 진폭에 대한 단일 셀 수준 막 투과화 감지의 작동 원리를 강조합니다. 전기천공 실험 개시 후, 세포 검출 알고리즘은 포인트-바이-포인트, 기울기 기반 검출 방법을 통해 세포 검출을 위한 최적의 임계값을 결정한다. 그런 다음 시스템은 측정된 전류의 상당한 음의 변화에 대해 (1)을 지속적으로 모니터링하며, 이는 셀의 유입을 나타냅니다. 이는 생물학적 .......
이 프로토콜에 제시된 방법론은 주로 특수 전기 천공 실험 설정에 통합되는 미세 유체 장치의 미세 가공에 중점을 둡니다. 미세 가공 공정의 세부 사항을 설명 할 때 자주 사용되는 '레시피'라는 용어는 작동하는 장치를 성공적으로 제작하기 위해 각 단계를 따르거나 최적화하는 것의 중요성을 암시합니다. 그러나 UV 노출 시간/에너지, PVD 스퍼터링 속도/지속 시간 및 산소 플라즈마 발생기 설정과 .......
Name | Company | Catalog Number | Comments |
150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
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