Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
Este protocolo descreve as técnicas de microfabricação necessárias para construir um dispositivo de eletroporação microfluídica de laboratório em um chip. A configuração experimental realiza transfecções controladas em nível de célula única em um fluxo contínuo e pode ser estendida a rendimentos mais altos com controle de base populacional. Uma análise é fornecida mostrando a capacidade de monitorar eletricamente o grau de permeabilização da membrana celular em tempo real.
As inovações terapêuticas atuais, como a terapia com células CAR-T, são fortemente dependentes da entrega de genes mediados por vírus. Embora eficiente, essa técnica é acompanhada por altos custos de fabricação, o que trouxe um interesse em usar métodos alternativos para a entrega de genes. A eletroporação é uma abordagem eletrofísica e não viral para a entrega intracelular de genes e outros materiais exógenos. Após a aplicação de um campo elétrico, a membrana celular permite temporariamente a entrega molecular na célula. Normalmente, a eletroporação é realizada em macroescala para processar um grande número de células. No entanto, essa abordagem requer um extenso desenvolvimento de protocolo empírico, o que é caro quando se trabalha com tipos de células primárias e difíceis de transfectar. O longo desenvolvimento de protocolos, juntamente com a exigência de grandes tensões para alcançar forças de campo elétrico suficientes para permeabilizar as células, levou ao desenvolvimento de dispositivos de eletroporação em microescala. Esses dispositivos de microeletroporação são fabricados usando técnicas comuns de microfabricação e permitem um maior controle experimental com o potencial de manter altas capacidades de rendimento. Este trabalho baseia-se em uma tecnologia de microfluídico-eletroporação capaz de detectar o nível de permeabilização da membrana celular em um nível de célula única sob fluxo contínuo. No entanto, essa tecnologia foi limitada a 4 células processadas por segundo e, portanto, uma nova abordagem para aumentar a taxa de transferência do sistema é proposta e apresentada aqui. Esta nova técnica, denotada como controle de feedback baseado na população celular, considera a resposta de permeabilização celular a uma variedade de condições de pulsação de eletroporação e determina as condições de pulso de eletroporação mais adequadas para o tipo de célula em teste. Um modo de maior rendimento é então usado, onde esse pulso "ideal" é aplicado à suspensão celular em trânsito. As etapas para fabricar o dispositivo, configurar e executar os experimentos microfluídicos e analisar os resultados são apresentadas em detalhes. Finalmente, esta tecnologia de micro-eletroporação é demonstrada através da entrega de um plasmídeo de DNA codificando para proteína fluorescente verde (GFP) em células HEK293.
As inovações terapêuticas atuais na pesquisa biomédica, como a terapia celular CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) e a edição genética usando CRISPR (sequências de DNA palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas)/Cas9, dependem fortemente da capacidade de fornecer material exógeno com sucesso e eficiência no espaço intracelular1. Na terapia CAR-T, o padrão-ouro para realizar a etapa de entrega gênica na fabricação da terapia celular é o uso de vetores virais2. Embora a entrega de genes mediada por vírus seja uma modalidade de entrega eficiente, ela também tem várias desvantagens. Estes incl....
NOTA: Os usuários devem revisar todas as MSDS para os materiais e suprimentos usados neste protocolo. Devem ser utilizados EPI adequados em cada etapa e técnica estéril utilizada durante a experimentação. As seções 1-7 discutem a fabricação do dispositivo.
1. Fabricação do dispositivo - Design da máscara
NOTA: Consulte a Figura 2 para obter uma ilustração do processo de microfabricação. As etapas de microf.......
A Figura 4 destaca os princípios operacionais por trás da detecção de permeabilização de membrana de nível de célula única para uma única amplitude de pulso. Após o início do experimento de eletroporação, o algoritmo de detecção de células determina um limiar ideal para a detecção de células por meio de um método de detecção ponto a ponto, baseado em inclinação. O sistema então monitora continuamente (1) uma mudança negativa significativa na corrente elétrica medi.......
A metodologia apresentada dentro deste protocolo se concentra principalmente na microfabricação de um dispositivo microfluídico que é então integrado em uma configuração experimental especializada em eletroporação. O termo "receita", que é frequentemente usado ao descrever as especificidades do processo de microfabricação, sugere a importância de seguir / otimizar cada etapa para fabricar com sucesso um dispositivo funcional. No entanto, certas etapas críticas dentro do processo, quando não otimizadas, com.......
Os autores gostariam de agradecer o apoio financeiro da National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) e do Treinamento de Pós-Graduação em Áreas Emergentes de Precisão e Medicina Personalizada do Departamento de Educação dos EUA (P200A150131) para financiar o estudante de pós-graduação J.J.S. em bolsa.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
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