Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
Этот протокол описывает методы микропроизводства, необходимые для создания микрофлюидного электропорационного устройства «лаборатория на чипе». Экспериментальная установка выполняет контролируемые одноклеточные трансфекции в непрерывном потоке и может быть расширена до более высокой пропускной способности с популяционным контролем. Представлен анализ, демонстрирующий возможность электрического мониторинга степени пермеабилизации клеточной мембраны в режиме реального времени.
Современные терапевтические инновации, такие как CAR-T-клеточная терапия, в значительной степени зависят от вирусно-опосредованной доставки генов. Несмотря на эффективность, этот метод сопровождается высокими производственными затратами, что вызвало интерес к использованию альтернативных методов доставки генов. Электропорация — это электрофизический, невирусный подход к внутриклеточной доставке генов и других экзогенных материалов. При приложении электрического поля клеточная мембрана временно допускает молекулярную доставку в клетку. Как правило, электропорация выполняется на макромасштабе для обработки большого количества клеток. Однако такой подход требует обширной разработки эмпирического протокола, что является дорогостоящим при работе с первичными и труднотрансфектируемыми типами клеток. Длительная разработка протокола в сочетании с требованием больших напряжений для достижения достаточной напряженности электрического поля для проницаемости ячеек привела к разработке микромасштабных электропорационных устройств. Эти микроэлектропорационные устройства изготавливаются с использованием распространенных методов микрофабрикации и позволяют осуществлять более широкий экспериментальный контроль с потенциалом для поддержания высокой пропускной способности. Эта работа основана на микрофлюидно-электропорационной технологии, способной обнаруживать уровень пермеабилизации клеточной мембраны на уровне одной клетки при непрерывном потоке. Однако эта технология была ограничена 4 ячейками, обработанными в секунду, и поэтому здесь предложен и представлен новый подход к увеличению пропускной способности системы. Этот новый метод, обозначаемый как контроль обратной связи на основе клеточной популяции, рассматривает реакцию пермеабилизации клеток на различные условия пульсации электропорации и определяет наиболее подходящие условия импульса электропорации для тестируемого типа клеток. Затем используется режим с более высокой пропускной способностью, где этот «оптимальный» импульс подается на суспензию ячейки в пути. Подробно представлены этапы изготовления устройства, настройки и проведения микрофлюидных экспериментов, а также анализа результатов. Наконец, эта технология микроэлектропорации демонстрируется путем доставки плазмиды ДНК, кодирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP), в клетки HEK293.
Современные терапевтические инновации в биомедицинских исследованиях, такие как CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) клеточная терапия и генетическое редактирование с использованием CRISPR (кластеризованные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторяющиеся последовательности ДНК) / Cas9, в значительной степени зависят от способности успешно и эффективно доставлять экзогенный материал во внутриклеточное пространство1. В терапии CAR-T золотым стандартом для выполнения этапа доставки генов в производстве клеточной терапии является использование вирусных векторов2. Хотя вирусно-опосредованная доставка....
ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи должны проверить все MSDS на наличие материалов и расходных материалов, используемых в этом протоколе. Соответствующие СИЗ следует носить на каждом этапе, а стерильную технику использовать во время экспериментов. В разделах 1-7 обсуждается изготовление устройст?.......
На рисунке 4 показаны принципы работы, лежащие в основе определения пермеабилизации мембраны на уровне одной ячейки для одной амплитуды импульса. После начала эксперимента с электропорацией алгоритм обнаружения клеток определяет оптимальный порог для обнаружения кле.......
Методология, представленная в этом протоколе, в первую очередь фокусируется на микропроизводстве микрофлюидного устройства, которое затем интегрируется в специализированную экспериментальную установку электропорации. Термин «рецепт», который часто используется при описании специ?.......
Авторы хотели бы отметить финансовую поддержку Со стороны Национального научного фонда (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) и Аспирантуры Министерства образования США в новых областях точной и персонализированной медицины (P200A150131) для финансирования аспиранта J.J.S. по стипендии.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved