La fabricación y operación de un sistema de microelectroporación de flujo continuo con detección de permeabilización

Este protocolo describe las técnicas de microfabricación necesarias para construir un dispositivo de electroporación microfluídica de laboratorio en un chip. La configuración experimental realiza transfecciones controladas a nivel de una sola célula en un flujo continuo y se puede extender a rendimientos más altos con control basado en la población. Se proporciona un análisis que muestra la capacidad de monitorear eléctricamente el grado de permeabilización de la membrana celular en tiempo real.

Las innovaciones terapéuticas actuales, como la terapia de células CAR-T, dependen en gran medida de la administración de genes mediada por virus. Aunque eficiente, esta técnica se acompaña de altos costos de fabricación, lo que ha provocado un interés en el uso de métodos alternativos para la administración de genes. La electroporación es un enfoque electrofísico, no viral para la entrega intracelular de genes y otros materiales exógenos. Tras la aplicación de un campo eléctrico, la membrana celular permite temporalmente la entrega molecular en la célula. Típicamente, la electroporación se realiza en la macroescala para procesar un gran número de células. Sin embargo, este enfoque requiere un extenso desarrollo de protocolos empíricos, lo cual es costoso cuando se trabaja con tipos de células primarias y difíciles de transfetar. El largo desarrollo del protocolo, junto con el requisito de grandes voltajes para lograr suficientes intensidades de campo eléctrico para permeabilizar las células, ha llevado al desarrollo de dispositivos de electroporación a microescala. Estos dispositivos de microelectroporación se fabrican utilizando técnicas comunes de microfabricación y permiten un mayor control experimental con el potencial de mantener altas capacidades de rendimiento. Este trabajo se basa en una tecnología de electroporación microfluídica capaz de detectar el nivel de permeabilización de la membrana celular a nivel de una sola célula bajo flujo continuo. Sin embargo, esta tecnología se limitó a 4 celdas procesadas por segundo, y por lo tanto se propone y presenta aquí un nuevo enfoque para aumentar el rendimiento del sistema. Esta nueva técnica, denominada control de retroalimentación basado en la población celular, considera la respuesta de permeabilización celular a una variedad de condiciones de pulso de electroporación y determina las condiciones de pulso de electroporación más adecuadas para el tipo de célula bajo prueba. Luego se utiliza un modo de mayor rendimiento, donde este pulso "óptimo" se aplica a la suspensión celular en tránsito. Los pasos para fabricar el dispositivo, configurar y ejecutar los experimentos microfluídicos y analizar los resultados se presentan en detalle. Finalmente, esta tecnología de microelectroporación se demuestra mediante la entrega de un plásmido de ADN que codifica para la proteína fluorescente verde (GFP) en las células HEK293.

Las innovaciones terapéuticas actuales en la investigación biomédica, como la terapia celular CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T cell) y la edición genética utilizando CRISPR (secuencias de ADN de repetición palindrómica cortas agrupadas regularmente interespaciadas) / Cas9, dependen en gran medida de la capacidad de entregar material exógeno tanto con éxito como de manera eficiente en el espacio intracelular¹. En la terapia CAR-T, el estándar de oro para realizar el paso de entrega de genes en la fabricación de terapia celular es el uso de vectores virales². Aunque la administración de genes mediada por virus....

NOTA: Los usuarios deben revisar todas las MSDS para los materiales y suministros utilizados en este protocolo. Se debe usar EPP apropiado en cada paso y se debe usar una técnica estéril durante la experimentación. Las secciones 1-7 discuten la fabricación del dispositivo.

1. Fabricación del dispositivo: diseño de la máscara

NOTA: Consulte la Figura 2 para obtener una ilustración del proceso de microfabricación. .......

La Figura 4 destaca los principios operativos detrás de la detección de permeabilización de membrana a nivel de una sola célula para una amplitud de pulso única. Tras el inicio del experimento de electroporación, el algoritmo de detección celular determina un umbral óptimo para la detección celular a través de un método de detección punto por punto, basado en pendientes. Luego, el sistema monitorea continuamente (1) un cambio negativo significativo en la corriente eléctrica medi.......

La metodología presentada dentro de este protocolo se centra principalmente en la microfabricación de un dispositivo microfluídico que luego se integra en una configuración experimental especializada de electroporación. El término "receta", que a menudo se usa cuando se describen los detalles del proceso de microfabricación, sugiere la importancia de seguir / optimizar cada paso para fabricar con éxito un dispositivo que funcione. Sin embargo, ciertos pasos críticos dentro del proceso, cuando no están optimizad.......

Los autores desean agradecer el apoyo financiero de la National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) y la Capacitación de Posgrado en Áreas Emergentes de Precisión y Medicina Personalizada del Departamento de Educación de los Estados Unidos (P200A150131) para financiar al estudiante graduado J.J.S. en beca.