Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
Detta protokoll beskriver de mikrofabrikationstekniker som krävs för att bygga en lab-on-a-chip, mikrofluidisk elektroporationsanordning. Den experimentella installationen utför kontrollerade transfektioner på encellsnivå i ett kontinuerligt flöde och kan utökas till högre genomströmningar med populationsbaserad kontroll. En analys tillhandahålls som visar förmågan att elektriskt övervaka graden av cellmembranpermeabilisering i realtid.
Nuvarande terapeutiska innovationer, såsom CAR-T-cellterapi, är starkt beroende av virusmedierad genleverans. Även om den är effektiv åtföljs denna teknik av höga tillverkningskostnader, vilket har medfört ett intresse för att använda alternativa metoder för genleverans. Elektroporering är ett elektrofysiskt, icke-viralt tillvägagångssätt för intracellulär leverans av gener och andra exogena material. Vid applicering av ett elektriskt fält tillåter cellmembranet tillfälligt molekylär leverans in i cellen. Typiskt utförs elektroporering på makroskalan för att bearbeta ett stort antal celler. Detta tillvägagångssätt kräver dock omfattande empirisk protokollutveckling, vilket är kostsamt när man arbetar med primära och svårtransfekta celltyper. Lång protokollutveckling, i kombination med kravet på stora spänningar för att uppnå tillräckliga elektriska fältstyrkor för att permeabilisera cellerna, har lett till utvecklingen av elektroporeringsanordningar i mikroskala. Dessa mikroelektroporeringsanordningar tillverkas med vanliga mikrofabrikationstekniker och möjliggör större experimentell kontroll med potential att upprätthålla hög genomströmningskapacitet. Detta arbete bygger på en mikrofluidisk-elektroporeringsteknik som kan detektera nivån av cellmembranpermeabilisering på en encellsnivå under kontinuerligt flöde. Denna teknik var dock begränsad till 4 celler som bearbetades per sekund, och därför föreslås och presenteras ett nytt tillvägagångssätt för att öka systemets genomströmning här. Denna nya teknik, betecknad som cellpopulationsbaserad återkopplingskontroll, tar hänsyn till cellpermeabiliseringssvaret på en mängd olika elektroporationspulserande förhållanden och bestämmer de bäst lämpade elektroporationspulsförhållandena för celltypen som testas. Ett högre genomströmningsläge används sedan, där denna "optimala" puls appliceras på cellsuspensionen under transport. Stegen för att tillverka enheten, ställa in och köra mikrofluidiska experiment och analysera resultaten presenteras i detalj. Slutligen demonstreras denna mikroelektroporeringsteknik genom att leverera en DNA-plasmid som kodar för grönt fluorescerande protein (GFP) till HEK293-celler.
Nuvarande terapeutiska innovationer inom biomedicinsk forskning, såsom CAR-T (Chimeric Antigen Receptor Engineered T-cell) cellterapi och genetisk redigering med CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeat DNA sequences)/Cas9, förlitar sig starkt på förmågan att leverera exogent material både framgångsrikt och effektivt till det intracellulära utrymmet1. I CAR-T-terapi använder guldstandarden för att utföra genleveranssteget i cellterapitillverkning virala vektorer2. Även om virusmedierad genleverans är en effektiv leveransmodalitet, har den också flera nackdelar. Dessa inkluderar tillverkningskostnade....
Användare bör granska alla säkerhetsdatablad för material och förnödenheter som används i detta protokoll. Lämplig personlig skyddsutrustning ska bäras vid varje steg och steril teknik ska användas under experiment. Avsnitt 1-7 diskuterar enhetstillverkningen.
1. Enhetstillverkning - Maskdesign
OBS: Se figur 2 för en illustration av mikrofabrikationsprocessen. Mikrofabrikationsstegen ska utföras i renrumsmilj?.......
Figur 4 belyser driftsprinciperna bakom detekteringen av membranpermeabilisering på encellsnivå för en enda pulsamplitud. Efter initieringen av elektroporationsexperimentet bestämmer celldetekteringsalgoritmen en optimal tröskel för celldetektering via en punkt-för-punkt, lutningsbaserad detektionsmetod. Systemet övervakar sedan kontinuerligt (1) för en signifikant negativ förändring i den uppmätta elektriska strömmen, vilket indikerar att en cell kommer in. Detta beror på det .......
Metoden som presenteras inom detta protokoll fokuserar främst på mikrofabrikation av en mikrofluidisk anordning som sedan integreras i en specialiserad elektroporationsexperimentell installation. Termen "recept", som ofta används när man beskriver detaljerna i mikrofabrikationsprocessen, antyder vikten av att följa / optimera varje steg för att framgångsrikt tillverka en fungerande enhet. Vissa kritiska steg i processen, när de inte optimeras, såsom UV-exponeringstid / energi, PVD-sputtringshastigheter / varakti.......
Författarna vill erkänna ekonomiskt stöd från National Science Foundation (NSF CBET 0967598, DBI IDBR 1353918) och US Department of Education's Graduate Training in Emerging Areas of Precision and Personalized Medicine (P200A150131) för att finansiera doktorand JJS på stipendium.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
150-mm diameter petri dishes | VWR | 25384-326 | step 6.1.1 to secure wafer |
24-well tissue culture plates | VWR | 10062-896 | step 10.3.6 to plate electroporated cells |
33220A Waveform/Function generator | Agilent | step 9.2.3 electroporation pulse generator | |
4'' Si-wafers | University Wafer | subsection 2.1 for microfluidic channel fabrication | |
6-well tissue culture plates | VWR | 10062-892 | step 8.1.8 to plate cells |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | step 2.1.2 for cleaning and step 5.1 photoresist lift-off |
Allegra X-22R Centrifuge | Beckman Coulter | steps 8.1.4 , 8.3.2. and 8.3.3. to spin down cells | |
AutoCAD 2018 | Autodesk | subsection 1.1. to design transparency masks | |
Buffered oxide etchant 10:1 | VWR | 901621-1L | subsection 3.1 for HF etching |
CCD Monochrome microscope camera | Hamamatsu | Orca 285 C4742-96-12G04 | step 11.2.3. for imaging |
CMOS camera- Sensicam QE 1.4MP | PCO | subsection 9.3 part of the experimental setup | |
Conductive Epoxy | CircuitWorks | CW2400 | subsection 7.6. for wire attachement |
Conical Centrifuge Tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-70C | step 8.1.4. for cell centrifuging |
Dektak 3ST Surface Profilometer | Veeco (Sloan/Dektak) | step 2.1.15 and 5.4 for surface profilometry | |
Disposable biopsy punch, 0.75 mm | Robbins Instruments | RBP075 | step 6.2.3 for inlet access |
Disposable biopsy punch, 3 mm | Robbins Instruments | RBP30P | step 6.2.3 for outlet access |
DRAQ5 | abcam | ab108410 | step 11.2.2. for live cell staining |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | ThermoFisher Scientific | 11885084 | step 8.1.2. part of media composition |
E3631A Bipolar Triple DC power supply | Agilent | step 9.2.1.-9.2.2.part of the experimental setup | |
Eclipse TE2000-U Inverted Microscope | Nikon | subsection 9.3. part of the experimental setup | |
EVG620 UV Lithography System | EVG | step 2.1.9. and 2.2.7. for UV Exposure | |
Fetal Bovine Serum | Neuromics | FBS001 | step 8.1.2. part of media composition |
FS20 Ultrasonic Cleaner | Fisher Scientific | subsection 5.1. for photoresist lift-off | |
Glass Media Bottle with Cap, 100mL | Fisher Scientific | FB800100 | step 8.2.1. for buffer storage |
Glass Media Bottle with Cap, 500mL | Fisher Scientific | FB800500 | step 8.1.2.for media storage |
HEK-293 cell line | ATCC | CRL-1573 | subsection 8.1 for cell culturing |
HEPES buffer solution | Sigma Aldrich | 83264-100ML-F | step 8.2.1 part of electroporation buffer composition |
Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 379212-25ML | step 2.2.3 adhesion promoter |
HF2LI Lock-in Amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
HF2TA Current amplifier | Zurich Instruments | subsection 9.2 part of the experimental setup | |
Isopropyl Alcohol | Fisher Scientific | A459-1 | step 2.1.2 for cleaning, step 2.1.14 for rinsing wafer following SU-8 development, and step 6.3.1 for cleaning PDMS |
IX81 fluorescence microscope | Olympus | step 11.2.3 for imaging | |
L-Glutamine Solution | Sigma Aldrich | G7513-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
M16878/1BFA 22 gauge wire | AWC | B22-1 | subsection 7.5 for device fabrication |
Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 208337-100G | step 8.1.2 part of electroporation buffer composition |
MF 319 Developer | Kayaku Advanced Materials | 10018042 | step 2.2.9. photoresist developer |
Microposit S1818 photoresist | Kayaku Advanced Materials | 1136925 | step 2.2.4 positive photoresist for electrode patterning |
Microscope slides, 75 x 25 mm | VWR | 16004-422 | step 2.2.1 electrode soda lime glass substrate |
Model 2350 High voltage amplifier | TEGAM | 2350 | step 9.2.5. part of the experimental setup |
National Instruments LabVIEW | National Instruments | data acquisition | |
Needle, 30G x 1 in | BD Scientific | 305128 | step 10.1.1. part of the system priming |
PA90 IC OPAMP Power circuit | Digi-key | 598-1330-ND | Part of the custom circuit |
Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4458-20ML | step 8.1.2. part of media composition |
Plasmid pMAX-GFP | Lonza | VCA-1003 | step 8.3.4. for intracellular delivery |
Plastic tubing, 0.010'' x 0.030" | VWR | 89404-300 | step 10.1.2. for system priming |
Platinum targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Pump 11 PicoPlus microfluidic syringe pump | Harvard Apparatus | MA1 70-2213 | step 10.1.4. for system priming |
PVD75 Physical vapor deposition system | Kurt J. Lesker | subsection 4.1. for physical vapor deposition | |
PWM32 Spinner System | Headway Research | steps 2.1.6 and 2.2.2. for substrate coating with photoresist | |
PX-250 Plasma treatment system | March Instruments | subsection 7.2 for PDMS and glass substrate bonding | |
SDG1025 Function/Waveform generator | Siglent | step 9.2.2. part of the experimental setup | |
Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S8045-500G | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
SU-8 2010 negative photoresist | Kayaku Advanced Materials | Y111053 | step 2.1.7. for microfluidic channel patterning |
SU-8 developer | Microchem | Y010200 | step 2.1.12. for photoresist developing |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-1KG | step 8.2.1. part of electroporation buffer composition |
Sylgard 184 elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | step 6.2.1 10 : 1 mixture of PDMS polymer and hardening agent |
Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | step 8.3.4. part of system priming |
SZ61 Stereomicroscope System | Olympus | subsection 7.3. for channel and electrode alignment | |
Tissue Culture Treated T25 Flasks | Falcon | 353108 | step 8.1.2 for cell culturing |
Titanium targets | Kurt J. Lesker | subsection 4.2. for physical vapor deposition | |
Transparency masks | CAD/ART Services | steps 2.1.9. and 2.2.7. for photolithography | |
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane | Sigma Aldrich | 448931-10G | step 6.1.2. for wafer silanization |
Trypsin-EDTA solution | Sigma Aldrich | T4049-100ML | steps 8.1.3. and 8.3.1. for cell harvesting |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved