Un système microphysiologique pour étudier l’interaction leucocytaire-endothéliale pendant l’inflammation

Résumé

Dans ce protocole, un test de microfluide biomimétique, qui peut reproduire un environnement microvasculaire physiologiquement pertinent et reproduire l’ensemble de la cascade d’adhésion / migration des leucocytes, est utilisé pour étudier les interactions leucocytes-cellules endothéliales dans les maladies inflammatoires.

Résumé

Les interactions leucocytaires-endothéliales jouent un rôle important dans les maladies inflammatoires telles que la septicémie. Au cours de l’inflammation, une migration excessive des leucocytes activés à travers l’endothélium vasculaire vers des organes clés peut entraîner une défaillance d’organe. Un test microfluidique biomimétique physiologiquement pertinent (bMFA) a été développé et validé à l’aide de plusieurs techniques expérimentales et informatiques, qui peuvent reproduire l’ensemble de la cascade de roulement/ adhésion/migration des leucocytes pour étudier les interactions leucocytes-cellules endothéliales. Les réseaux microvasculaires obtenus à partir d’images in vivo chez des rongeurs ont été numérisés à l’aide d’une approche de système d’information géographique (SIG) et microfabriqués avec du polydiméthylsiloxane (PDMS) sur une lame de microscope. Pour étudier l’effet de la vitesse de cisaillement et de la topologie vasculaire sur les interactions entre les cellules leucocytes et endothéliales, un modèle de dynamique des fluides computationnelle (CFD) a été développé pour générer une carte correspondante des taux de cisaillement et des vitesses dans l’ensemble du réseau. Le bMFA permet de quantifier les interactions leucocytaires-cellules endothéliales, y compris la vitesse de roulement, le nombre de leucocytes adhérents en réponse à différents taux de cisaillement, le nombre de leucocytes migrés, la perméabilité des cellules endothéliales, l’expression des molécules d’adhésion et d’autres variables importantes. De plus, en utilisant des échantillons liés à l’homme, tels que des cellules endothéliales humaines et des leucocytes, l’AGB fournit un outil de dépistage rapide des traitements potentiels afin d’augmenter leur translatabilité clinique.

Introduction

L’inflammation est la réponse de l’hôte à l’infection et à la blessure, et l’endothélium joue un rôle important dans la réponse inflammatoire ^1,2,3. Le dérèglement inflammatoire est la cause sous-jacente d’un certain nombre de pathologies telles que la septicémie, les maladies cardiovasculaires, l’asthme, les maladies inflammatoires de l’intestin, le cancer et la COVID-19. Les interactions leucocytaires-endothéliales jouent un rôle central dans ces maladies inflammatoires. Au cours de l’inflammation, la libération de PAMPS (modèles moléculaires associés à des agents pathogène....

Protocole

Le sang humain héparinisé est obtenu pour l’isolement des neutrophiles auprès de donneurs adultes en bonne santé (hommes et femmes, âgés de 21 à 60 ans), après consentement éclairé approuvé par l’Institutional Review Board de Temple University (Philadelphie, PA, États-Unis).

1. Amorçage et revêtement de l’appareil avec de la fibronectine humaine

REMARQUE: Le bMFA dispose de deux ports d’entrée et de deux ports de sortie connectés au compartiment vasculaire. Il dispose également d’un port relié au compartiment tissulaire (Figure 2).

1. Insérer un tube (O.D. de ....

Résultats

Après 48 h de culture sous écoulement de cisaillement dans la bMFA, les cellules endothéliales recouvraient la surface des canaux vasculaires dans la bMFA et s’alignaient dans le sens de l’écoulement (Figure 6). La microscopie confocale a indiqué que toutes les surfaces des canaux vasculaires étaient recouvertes de cellules endothéliales, formant une lumière 3D complète dans bMFA¹⁸.

En utilisant ce protocole, une carte d’adh?.......

Discussion

Le bMFA reproduit la topographie et les conditions d’écoulement des réseaux microvasculaires in vivo et peut être utilisé pour étudier l’interaction cellule leucocytaire-endothéliale et la fonction endothéliale in vitro dans des conditions physiologiquement réalistes. Dans la microvascularisation de la souris ou de l’homme, la géométrie des réseaux microvasculaires est auto-similaire et fractale, et le nombre de Reynolds << 1, ce qui indique que la géométrie vasculaire n’a pas d’i.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	Fisher Scientific	14-823-30
Biomimetic microfluidic assay (bMFA)	SynVivo	SMN1-C001	Exclusive at SynVivo
Blunt needle	Jensen Global	JG24-0.5
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C70-500
CFDA, SE	ThermoFisher	C1157
Dextran, 250,000, Powder	Spectrum Chemical Mfg. Corp	DE-130
Ficoll-Paque Premium	GE Health Care	17-5442-02	Leukocyte isolation media
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506
Hepes	Fisher Scientific	AAJ1692630
Human fibronectin	Fisher Scientific	33-016-015	use vendor recommended ECM for different cell lines
Microvascular Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	cc-3202	Human lung microvascular endothelial cell culture medium (HLMVEC).
Human lung microvascular endothelial cells	Lonza	cc-2527	use vedor remommended trypsin-EDTA and TNS
Magnesium Chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments Inc.		Microscope
NIS-elements, 5.20.01	Nikon Instruments Inc.		Imaging software
PBS	Fisher Scientific	MT21040CV
PhD Ultra Syringe Pump	Harvard Apparatus	70-3007	Syringe Pump
Potassium Hydroxide	Fisher Scientific	02-003-763
Recombinant Human TNF-alpha	R&D Systems	210-TA
Slide clamp	SynVivo
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640-500
Synvivo Pneumatic Primer	SynVivo
Trypsin-EDTA, Trypsin Neutralization Solution(TNS)	Lonza	cc-5034
Tygon tubing	Fisher Scientific	50-206-8921	Tubing