ミニブタのキャリアへのRPEの網膜下移植:術前準備、手術手技、および術後ケアのガイドライン

Summary

網膜色素上皮(RPE)の網膜下移植は、変性網膜疾患の治療のための最も有望なアプローチの1つです。しかし、大眼動物モデルでの前臨床試験の実施は依然として困難です。このレポートは、ミニブタへの細胞キャリア上のRPEの網膜下移植のガイドラインを提示します。

Abstract

主に網膜色素性上皮(RPE)層またはその内部で発生する網膜の変性疾患(加齢黄斑変性症を含む)は、網膜解剖学的構造の進行性の混乱および視覚機能の悪化をもたらす。網膜下細胞キャリアを用いた in vitro 培養RPE細胞による損傷したRPE細胞(RPE)の置換は、網膜外層の解剖学的構造を再確立する可能性を示しており、したがって、さらなる研究が行われている。ここでは、培養RPEを含む細胞キャリアのミニブタへの効果的な網膜下移植を可能にする外科的手法の原理を紹介します。手術は全身麻酔下で行われ、標準的なレンズ温存3ポートパースプラナ硝子体切除術(PPV)、平衡塩溶液(BSS)の網膜下塗布、2.7 mm網膜切開術、追加の3.0 mm硬化切開術、流体空気交換(FAX)、シリコーンオイルタンポナーデ、およびすべての硬化切開術の閉鎖による網膜下腔へのナノ線維細胞キャリアの移植が含まれていました。この外科的アプローチは、過去8年間で29回の手術(18匹)で使用され、成功率は93.1%でした。外科的留置の解剖学的検証は、 in vivo 眼底イメージング(眼底写真および光干渉断層撮影)を用いて行った。ミニブタの眼のキャリアへのRPEの網膜下移植に推奨される外科的ステップは、大眼動物モデルを使用した将来の前臨床試験で使用できます。

Introduction

加齢黄斑変性症(AMD)は、先進国における中心視力喪失の主な原因と考えられており、網膜色素性上皮(RPE)機能障害に関連する多くの状態の1つです^1,2。RPEは、基本的に位置するブルッフ膜(BM)上にあり、光受容体に必要なメンテナンスを提供します。RPE層の進行性変性は、AMDの初期萎縮型の特徴であり、後期滲出型AMDの開発にも伴います。網膜疾患治療には多くの進歩があるにもかかわらず、効果的な治療法の開発は依然として困難です³。有望な方法の1つは、in vitro培養RPE層を用いたRPE置換である。この治療法は、ヒト胚性幹細胞由来RPE(hESC-RPE)や人工多能性幹細胞由来RPE(iPSC-RPE)を用いた幹細胞研究の進展と関連しています3,4,5,6,7。近年、多くの研究グループは、最初に受け入れられた概念実証8,9,10,11,12,13,14,15を使用して、RPE置換のためのさまざまなアプローチの開発に焦点を合わせています。RPE細胞(RPE)は、通常、細胞懸濁液、自立性細胞シート、または人工担体によって支持された細胞単層の形態で網膜下腔に送達される³、¹⁶、17、¹⁸、¹⁹、^20、21。細胞懸濁液の注入が最も簡単な方法ですが、BMの妥協した状態はしばしば移植細胞の付着を妨げる可能性があります。これは、RPEsの不正確な尖頭基底配向および単層の形成の失敗をもたらし得る^22、23。他の2つの方法(すなわち、自己支持性細胞シートおよび人工基質によって支持された細胞単層)の主な利点は、細胞が網膜下腔²⁴に直接移植されたときに既に分化した単層状態にあることである。

網膜下腔への細胞キャリアの送達を記述する多くの外科的技術が、近年^{公開されている8}、^9、10、11、^12、13、^14、15。これらの研究では、大眼動物モデルの使用、細胞キャリアの種類、移植細胞培養の使用、移植器具、および外科的技術が説明されており、著者は主に網膜下移植の結果に焦点を当てていました。2015年、Popelkaらは、ブタの死体の目へのRPEの移植にフレーム支持された極薄電界紡糸ポリマー膜の使用を報告しました⁸。細胞キャリアの網膜下移植を伴うここで説明する外科的手法は、キャリアの比較的正確な取り扱いおよび網膜下腔における足場の容易な位置決めを可能にした。Kozakらは、ブタの目で約2 mm x 5 mmのサイズのキャリアの送達技術の実現可能性を評価しました⁹。セルキャリアのユニークな設計により、正しい配置が可能になり、セルラー単層が折りたたまれてしわになるのを防ぎました⁶。Al-Nawaisehらは、ウサギへの網膜下足場移植に関する詳細な段階的ガイドラインを最初に提示した²⁵。その後、Stanzelらは、2019年に小型げっ歯類、ウサギ、ブタ、および非ヒト霊長類への移植のための同様のプロトコルを発表しました²⁶。以前に発表されたように、分化および分極されたRPE単層を固体担体に移植すると、他の送達技術と比較して、生存率が向上し、移植片のより良い統合がもたらされました(補足ファイル1)²⁷。

in vivoで実施される前臨床動物研究の目的は、手順の安全性、移植された細胞の生存、網膜下操作に対する組織反応、および短期および長期の術後転帰に焦点を当てた、細胞キャリアの外科的経硝子体網膜下移植のさまざまな側面を明らかにすることです。大眼動物モデルとしてのブタの目の使用は、得られたデータの範囲に関して関連性があると報告されており、これは有用であり、ヒトに適用できる可能性がある^10,11,14。私たちの研究は、大眼動物モデルにおける細胞キャリアのin vivo網膜下移植に使用される外科的技術を報告しています。術前準備,網膜下細胞キャリア移植術の手技,ミニブタ眼の術後ケアについて,過去8年間の経験をもとに詳述する.さまざまな種類の細胞や細胞キャリアの移植を含むin vivo実験研究に使用できる基本的な手術原理について説明します。

大型動物モデル
Liběchovミニブタの実験的な群れは、1967年に米国からホーメル株から5匹の動物を輸入することによって設立されました。これらの動物は、ブタの血液型研究のために、他のいくつかの品種または系統(ランドレース、ラージホワイト、コーンウォール、ベトナム豚、およびゲッティンゲン起源のミニチュア豚)と交配されました^28,29。生後5か月、体重(BW)が約20 kgになると、ミニブタは性的成熟に達します。親のミニブタ品種(ホーメルとゲッティンゲン)の生存率は12〜20年と報告されています。細胞キャリアの網膜下移植は、網膜の中央部分を標的とする。ミニブタの網膜には黄斑と中心窩がありません。しかし、それは領域セントラリスおよび視覚縞^30,31と呼ばれる高濃度の錐体光受容体の領域を有する。これらの領域は最高の視力の原因です。

手術は、経験豊富な外科施設助手(TA)の助けを借りて、4人の経験豊富な硝子体網膜外科医によって行われました。 in vivo 実験の前に、外科医は教育を受け、硝子体容積に対する水晶体の比率が低いこと、軸方向の長さが短い(15〜19 mm)、角膜にボーマン膜がないこと、硝子体容積が小さいこと(2.8〜3.2 mL)、黄斑と中心窩がないことなど、ミニブタの目の解剖学に関する特別な知識を得ました。 ジンの輪がないこと、および視神経乳頭の直径(垂直/水平:1.5 mm / 2.1 mm)。すべての場合において、手術は、標準的な無菌および消毒措置の実施を伴う特別に組織された手術室で全身麻酔下で行われた。

Protocol

この研究は、ヘルシンキ宣言のガイドラインの信条と、人間を対象とする医学研究の倫理原則に準拠しています。すべての実験は、実験動物の世話と使用のためのガイドライン、および眼科および視覚研究における動物の使用に関する視覚眼科学研究協会(ARVO)に従って実施されました。研究プロトコルは、チェコ科学アカデミーの動物生理学および遺伝学研究所(チェコ共和国リビェホフ)の動物実験プロジェクトの承認のためにCASのリゾート専門家委員会によって承認されました(承認されたプロトコル番号60/2016および第64/2019)。

1. 担体上の細胞のミニブタへの網膜下移植時の考察

1. 動物の選択
   1. 生後12〜36か月、性別を問わず、体重(BW)が約40〜80 kgのLiběchovミニブタを入手して使用します。
   2. ミニブタを、温度が18〜22°C、人工的な13時間/ 11時間の明暗サイクル、標準化された個々のペン、水への無料アクセス、および1日2回の給餌で、エアコン付きの動物小屋で屋内に保管してください。
2. 手術前の準備
   1. 目の外科的向きを確認し、眼底スキームを描きます。そのためには、縦線のペンを使用して、眼底図のミニブタの網膜を側頭(視神経乳頭から耳に向かって)、鼻(視神経乳頭からブタの鼻に向かって)、および中央(鼻側の主要な網膜血管の間)領域に概略的に分割します(図1A、B)。
   2. 行動的および神経学的病理がなく、皮膚、体の開口部、糞便、および食物消費の質が正常な健康な動物のみを選択してください。熟練した獣医師に臨床観察を行ってもらい、動物を選択します。
   3. 手術当日に塩酸セフチオフル(1 mL / kg)の3 mg / kgBWを筋肉内注射します。.
3. 術前免疫抑制
   1. タクロリムス溶出ポリマーミクロスフェアを改変してWangらおよびSevcら^32,33に記載されているように調製する。
   2. ポリマーミクロスフェア中のタクロリムスの濃度がHPLC(材料表)によって決定されるように51.3 mg / gであることを確認してください。.
   3. 細胞移植片の拒絶反応を妨げるために、眼科手術の6日前にタクロリムスを装填したポリマーミクロスフェアを0.25 mg / kg BWの用量で皮下注射します。.これは、ミニブタの眼への異種移植中のヒトRPEドナー細胞の生存を確実にするために行われる。
   4. 手術当日に、体重に応じて80 mgのデポメドロールとベンジルペニシリンを1 mL / 10 kgで筋肉内注射します。.
4. 麻酔
   1. 手術前に、チレタミン(2 mg / kg)、ゾラゼパム(2 mg / kg)、ケタミン(2 mg / kg)、およびキシラジン(0.4 mg / kg)-TKX^34,35の混合物の筋肉内注射で全身麻酔を誘発します。.意識不明の状態と、ペダル反射(後脚の指間皮膚のつまみ)、角膜反射(角膜のわずかな接触)、瞳孔反射(光への反応)、眼瞼反射(まぶたへの接触)をチェックして、麻酔の深さを確認します。動物が点滅しないようにしてください。心臓と呼吸数の規則性を確認します。
   2. 麻酔導入後、鎮静動物をリフトトロリーで手術室に輸送する(図2A)。
   3. 動物を左側の手術台に置き、右目の手術を可能にします(図2B)。
   4. 発泡スチロールパッドを使用して動物の頭の調整を行い、移植に最適な中央網膜の位置(つまり、床に対して水平および平行)を実現します(図2C)。
   5. 0.5%塩酸プロパラカイン点眼液の点眼薬を結膜嚢に1分間隔で3回入れ、局所麻酔を誘発します。.
   6. 静脈カニューレを挿入し、患者モニターを備えた麻酔器を使用して麻酔(1.5%イソフルラン)の吸入維持のために気管内チューブで動物に挿管します(図2A、B)。
   7. 眼科手術開始の約15分前に、16 kg BWあたり1 mLのエフィカーと20 mgのデポメドロール1の筋肉内注射を投与します(材料表)。
   8. 動物を等温ホイルで覆うことによって生理学的体温を維持し、セクション3で説明されているように手術を行います。
   9. 手術中は、イヤークリップと患者モニターを使用して、心拍数と血中酸素飽和度とともに動物の体温を監視します。安全限界³⁶と見なされる処置中の体温の38°C未満の低下は避けてください。実験全体を通して、酸素飽和度(>96%)と脈拍数(毎分70〜90拍)を維持します。
   10. 手術が完了したら、イソフルランの流れを止めて動物を抜管します。
   11. 自発呼吸と目覚めの後、動物をペンに移します。
5. 手術室のセットアップ
   1. 大眼動物モデルの目の手術の必要性に応じて手術室を配置します(図3A、B)。外科医の椅子の高さと顕微鏡の高さを調整して、ブタの鼻の位置に関して外科医にとって快適な位置を実現します。

図1:ミニブタの網膜帯の模式図。 (A)ミニブタの頭部に対する網膜帯の模式図。黄色の楕円は網膜下移植の所望の領域を示し、Tは側頭網膜領域を指し、Nは鼻網膜領域を指す。(B)網膜切開術(赤)による細胞キャリア(黄色)の網膜下移植後の眼底スキームの例。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:動物の輸送と配置 。 (A)鎮静された動物の手術室への輸送。(B)挿管中の動物の配置。(C)手術中に中心網膜への最適なアクセスのための動物の頭部の調整(赤い矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:標準的な手術室のセットアップ 。 (A)ミニブタ、手術顕微鏡(OM)、硝子体切除装置(VM)、器械台(IT)、麻酔器(AM)を備えた手術台の位置に対する外科医の位置(S =外科医、A =助手)の概略図。硝子体切除術機には2つの可能な位置(黄色と灰色)があります。(B)手術室での実際の設定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2.細胞キャリア、培養細胞培養、および移植インジェクター

1. セルキャリア
   1. 厚さ36μmのポリエチレンテレフタレート(PET)箔から、フレーム上に非対称に配置された三角形の突起を備えた、外形寸法1.7mm x 4.8mmの幅30μmの楕円形フレーム(図4A)を、フェムト秒レーザーを使用して切断します。
   2. 溶液1 gあたり2.2 μLのギ酸を添加して、ピリジン中のポリ(L-ラクチド-co-DL-ラクチド)(LLA/DLLA 90/10、MW 868、270 g / mol)ポリマー溶液を11 wt%の濃度で調製します。
   3. ポリマー溶液のエレクトロスピニングにより、支持フレームが埋め込まれたナノファイバー膜(図4B)を3つのステップ⁸で準備します:(1)シリコン基板上にナノファイバーの第1層を堆積し、(2)層上にフレームを配置し、(3)ナノファイバーの第2層を堆積します。
      注:すべての層を7分間堆積させて、膜の総厚さ3.7μmに到達します。厚さ380 nmの繊維で構成され、平均孔径が0.4 μm、空隙率が約70%³⁷のメンブレンを得るには、20 Gの全鋼針、電圧7.1 kV、ギャップ10 cm、流速250 μL/min、温度25.0 °C±0.5 °Cのパラメータを使用します。
   4. フレームが埋め込まれたメンブレンをシリコン基板から慎重に取り外し、元のメンブレンのない市販の12ウェル細胞培養インサートの本体に固定して、細胞の播種と成長を促進します。
   5. 細胞播種前にナノ繊維膜をプラズマ中で70Wの電力で30秒間プラズマクリーナーで処理します。
2. 細胞担体上での培養に用いる細胞培養
   注:以下の細胞担体を使用することができる:1)細胞を含まないナノ繊維状細胞担体。2)初代ヒトRPE(hRPE)を有するナノファイバー状細胞キャリア;3)ヒトiPS細胞由来RPE細胞を有するナノファイバー状細胞キャリア。
   1. 初代hRPEの培養
   2. 初代hRPE細胞をヒトドナー眼から単離することは、既報の技術^{に従って38}である。
   3. 網膜を30分間酵素処理して細胞を得る。その後、初代hRPE細胞(継代0)を、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したDMEM/F12中で最大2週間培養します。
   4. 細胞培養がコンフルエントに達したら、培地を1%FBSに変更し、さらに30日間培養します。
   5. 初代hRPEをトランスウェルプレート上およびラミニンコーティングされたナノファイバー状細胞担体上に2,000細胞/^mm2の密度で播種します。1%FBSでさらに30日間インキュベートした後、ミニブタへの網膜下移植に一次hRPEを含む細胞キャリアを使用します。
3. ヒトiPS細胞由来RPE
   1. CRISPR/Cas9システムを用いて2つの対立遺伝子で遺伝子補正されたMERTK関連網膜色素変性症患者由来の線維芽細胞³⁹ 由来のhiPSC(RP1-FiPS4F1-GC2)⁴⁰、および対照として使用される健常者の線維芽細胞由来のhiPSC(Ctrl2-FiPS5F2)⁴¹ を使用します。
   2. 以前に報告されているようにRPE細胞(hiPSC-RPE)に向けて両方のhiPSC細胞株を生成し、続いて分化させる⁴²。
   3. ノックアウトDMEM、20%ノックアウト血清、0.1 mM非必須アミノ酸、0.23 mM β-メルカプトエタノール、100 U/mLペニシリン、0.1 mg/mLストレプトマイシン、および10 mMニコチンアミドを含むRPE培地に、楕円形の移植フレームを備えたポリ(L-ラクチド-co-DL-ラクチド)のナノファイバー膜を備えたラミニンコーティング細胞培養インサートにhiPSC-RPEを200,000細胞/^cm2 でプレートします。
   4. 1日おきに培地を交換し、移植前に2ヶ月間hiPSC-RPEを培養して分極増殖を促します。
4. 埋め込み型インジェクター
   1. 外径1.75 mm/内径1.10 mmのプラスチックチューブからブロー成形により、断面2.8 mm x 0.8 mmの長方形のプラスチックキャピラリーを準備します。
   2. 端から4 mmのプラスチックキャピラリーで2.2 mm x 6 mmのローディングウィンドウを切り取ります。
   3. プラスチックキャピラリー、シリコンハンドル、スチールブレードプランジャー、およびピストンからインジェクターを組み立てます(図5A)。
   4. ローディングウィンドウを介してキャリアをインジェクターにロードし、後で手順3.5.2(図5B)で説明されているように、プランジャーを押して網膜下腔に排出します。
5. ナノ繊維状担体の調製およびインジェクタの装填
   1. 小さなプラスチック製のペトリ皿に2 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を入れます。準備した細胞層でインサートを取り出し、半柔らかいポリスチレン皿の上に置き、光学顕微鏡で中央に配置します。カスタム修正されたパンチを使用して、顕微鏡を使用して楕円形のフレームに沿ってキャリアを切り取ります。キャリアの寸法は2 mm x 5 mmです。
   2. キャリアを装填するために、平らな透明なチューブを備えたカスタムメイドのインジェクターを使用してください。キャピラリーの遠位端から6mmのところに、キャリアを装填するための窓がある。インジェクターのウィンドウをPBSで満たします。
   3. 鉗子を使用して、ディッシュの底からサンプルを放出し、液体から持ち上げ、最初にフレームの側面の向きマークを確認しながらインジェクターの窓に輸送し、接着細胞のあるキャリアの上面を検出します。楕円形のフレームは、キャリアの操作を容易にします。
   4. 歯科用プローブ(先端が鋭いステンレス鋼の歯科用器具)を使用して、キャリアをインジェクターの窓に配置します。プランジャーを使用して、キャリアをインジェクターの閉じた安全な上部に押し込みます。次に、手術のためにキャリアを準備します。
   5. 各ステップでキャリアの側面の向きを確認してください。金属プランジャーを押して、ナノファイバーキャリアをインジェクターからアンロードします。

図4:支持PETフレームが埋め込まれたナノ繊維キャリア。 (A)フレーム上の3つの目に見えるマークにより、キャリアの側面の向きを制御できます(白い矢印)。(b)細胞担体のナノ繊維膜に埋め込まれたPETフレーム断片の拡大図(白抜き矢印)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:植込みインジェクター 。 (A)インジェクターの部品。(B)移植インジェクターのプラスチック長方形キャピラリーに装填された埋め込み支持PETフレームを備えたナノ繊維状細胞キャリア。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3.外科的処置

1. 手術器具
   1. 次の手術機器を使用してください:眼科手術用顕微鏡、前眼部と後眼部の手術用のオペレーティングシステム、非接触硝子体網膜手術システム、レーザー光凝固装置、およびデジタルカメラ。
      注:硝子体切除術、外焼灼および内視鏡、およびレーザー光凝固装置で使用される標準パラメータを 表1に示します。
2. 手術器具
   1. 再利用可能な手術器具は、標準的なプロトコルに従って、移動式オートクレーブ蒸気滅菌器または同様のもので滅菌します。手術中に必要な使い捨ての手術器具および材料は、 材料の表に記載されています。
3. 手術ステップの準備
   1. ステップ1.4.1に記載されるように動物に麻酔をかけた後、薬物誘発散瞳を誘発する処置の15分前に結膜嚢に1%トロピカミド溶液点眼薬および10%塩酸フェニレフリン溶液を塗布する。
   2. 外科医を上の位置に、助手を横の位置にして手術台に近づきます(図3)。
   3. 使い捨てのシェービングカミソリで目元を剃り、ざらざらした汚れを取り除きます。
   4. 結膜嚢を5%ポビドンヨード溶液で5分間消毒する。
   5. まぶたから周辺までこすり洗いして、綿棒で眼窩周囲を消毒します。10%ポビドンヨード溶液を使用してこのプロセスを3回繰り返し、5分間そのままにします。
   6. 粘着性のある透明なホイルを備えた標準的な滅菌眼科用ドレープを使用して、中央の目で手術野を覆います。まつげをアイグローブから離します。術後の眼内炎のリスクを減らすためにまつげを切ることは避けてください。
   7. 蓋の検鏡(リーベルマンタイプまたはクックアイスペキュラム)を挿入します。必要に応じて、硝化膜を8-0で皮膚に固定しますポリグラクチン縫合糸。
   8. 外科用鉗子とウェストコット結膜ハサミを使用して強膜を露出させるために、リンバスから2 mmから3 mmの鼻側の結膜を開きます。
   9. 3バルブの25 Gトロカールをリンバスから2.5〜3 mm、パースプラナの領域に挿入します(7時、10時、11時に置きます)。挿入中は、後網膜に向かってわずかに斜め(100°〜110°)で回転運動を使用し、鉗子でトロカールを保持します(図6)。
   10. 浸透圧性角膜浮腫を防ぐために、手術中は角膜を濡らしておくか、メチルセルロースでコーティングしてください。
4. 扁平硝子体切除術(PPV)
   1. 標準的な3ポートパープラナ硝子体切除アプローチで硝子体の中央部分を取り除きます。将来の大硬化切開術の領域でレンズの後ろの硝子体を慎重に取り除きます。
   2. 制御された後部硝子体剥離を行うために、硝子体内2〜4mgのトリアムシノロンアセトニド(TA)注射(50〜100μL)を使用して、通常は網膜に付着したままである後部硝子体を染色する。
   3. その後、0.05〜0.1 mLのBSSの網膜下注射をゆっくりと行い、41 Gのカニューレをより中央に行い、末梢に向かってブレブが形成されないようにします。
   4. 一過性の網膜血管閉塞を防ぐために、網膜下注射中に灌漑システムで眼圧設定を15mmHgまで下げます。.
   5. 鼻ブレブ基部の近くに27 Gのエンドジアテルミープローブを使用して、網膜の線形の大きなエンドジアテルミーを実行します。
   6. その後、25 G MVRブレードまたは垂直ハサミを使用して3 mmの大きな網膜切開を行い、灌漑システムの眼圧(IOP)設定を最大60 mmHgに3分間〜5分間上げます。網膜切開術による出血がないことを確認してから、IOPを25 mmHgに下げます。
   7. 強膜の表面に穏やかなタッチを適用することにより、27Gの内視鏡プローブを使用して、リンバスから2.5〜3 mmの2つの鼻トロカールの間の上膜血管のエキソジアテルミーを実行します。
   8. 強膜切開の拡大後、水分消費量が一時的に多いため、強膜切開を拡大する前に輸液ボトルの液面を確認してください。
   9. 2.75 mmのファコナイフを使用して、リンバスから3 mmのところに3.0 mmの大きな硬化性切開術を行います。
   10. 大強膜切開術内の強膜血管および毛様体からの出血の可能性に注意してください。出血の場合は、27 Gのエンドジアテルミープローブを使用して損傷した血管を凝固させます。インジェクターの先端(0.8 mm x 2.8 mm)を収容するために、サテンナイフで硬化切開術を3.0 mmに拡大します。
   11. 硝子体で大きな強膜切開部位の脱出した硝子体を取り除きます。地球儀の崩壊を避けるために硝子体切除術システムを使用してBSSの注入を25〜30 mmHgのレベルに維持します。
5. 細胞担体の移植
   1. 利き手でインジェクターを大きな強膜切開術を通して硝子体腔にそっと挿入します。抵抗がある場合は、強膜切開のサイズを拡大します。
   2. 網膜切開術を通して細胞キャリアを網膜下腔に移植する。必要に応じて、移植の制御を改善するために、追加の硬化切開術とシャンデリアライトを備えたバイマニュアル技術を使用してください。
   3. インジェクターを目から引き出し、8-0で大硬化膜切開を閉じます眼内低張に関連する合併症を回避するためのポリグラクチン縫合糸。
   4. 完全な流体 - 空気交換(FAX)を行い、シリコンチップカニューレで網膜下液の排液を行います。
   5. その後、眼圧が正常になるまで、硝子体切除システムとシリコーンオイル注入用のチューブシステムを使用して、シリコーンオイル(1,000 cSt)を硝子体腔に注入します。
6. 術中のイメージングとドキュメンテーション
   1. ビデオ録画システムを使用して、移植の重要なステップの写真文書化を使用して、手術全体を通してビデオ録画を実行します。
   2. 眼底採取スキーマを使用して、硬化切開、網膜切開術、網膜下インプラント、および発生した合併症の位置を文書化することにより、眼底図を完成させます。
7. 手術後の手順
   1. 手術の終わりに、トロカールを取り除き、3つの硬化切開と結膜を8-0で閉じますポリグラクチン縫合糸。
   2. 結膜嚢を5%ポビドンヨード溶液ですすいでください。
   3. 20 mgのゲンタマイシン、2 mgのデキサメタゾン、および2%キシロカインの0.3 mL結膜下注射を行います。
   4. 眼底と水晶体の状態を顕微鏡で確認します。
   5. 外科用鉗子とウェストコット結膜はさみ(オプション)を使用して、乳炎膜から縫合糸を取り除きます。
   6. ネオマイシン軟膏またはオフロキサシン眼軟膏を結膜嚢に塗布する。

図6:ミニブタの目へのトロカールの挿入。 (A)水晶体の損傷を避けるために、ヒトの眼では硝子体腔の中心に向かって強膜に垂直に挿入され(灰色)、ミニブタの眼では後網膜に向かって斜めに挿入されるトロカールの概略図(青色)。ミニブタの水晶体(青色)は、ヒトのそれよりも大きく、硝子体腔のサイズに比べて大きい。(B)3ポートPPVに挿入されたトロカールの術中ビュー。角膜はメチルセルロースで覆われており、乾燥や腫れを防ぎます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4.術後ケア

1. 局所バシトラシン亜鉛/酢酸ヒドロコルチゾン/硫酸ネオマイシンまたは0.3%オフロキサシンを動物の結膜嚢に1日5回塗布します。.
2. 術後、次の眼のパラメータを確認してください:触診を使用した眼の軟部組織の膨満、眼表面の炎症反応、およびハンドヘルドスリットランプまたは間接検眼鏡を使用したまぶたの保護反応としての斜視。
3. 全身術後ケアには、以下の抗生物質を使用してください。
   1. 安定性の2日目と3日目に3 mg / kg BW(1 mL / kg)の用量で塩酸セフチオフルを筋肉内注射します。.
   2. 二次細菌感染の予防のために、術後72時間後にツラスロマイシン(1 mL / 40 kg BW)を注射します。.
4. 痛みを防ぐために、フルニキシン(2 mL / 45 kgの生体重)と塩酸トラマドール(100 mg)を手術後3日間、24時間ごとに筋肉内注射を行います。.
5. ミニブタは、18〜22°Cの温度範囲と人工的な13時間/ 11時間の明暗体制を備えた特殊な空調施設に保管してください。
6. 彼らが水と標準的な給餌(1日2回)に自由にアクセスできるようにします。

5.術後処置

1. 術後眼科検査
   1. 術後の期間に、間接検眼鏡で炎症の存在(すなわち、結膜嚢の発赤、組織の腫脹、または粘液の鬱血)を検査します。触診法を用いて手術眼の眼圧を測定します。
2. 術後イメージング
   1. 眼底写真およびOCT検査の前にTKX混合物の筋肉内注射によってミニブタに鎮静を誘発する。散瞳を誘発するために、1%トロピカミドと10%塩酸フェニレフリン点眼薬をミニブタの結膜嚢に注入します。.
   2. 開いた目を維持するために蓋検鏡を使用します。目の表面に潤いを与え、鮮明なOCT画像を得るために、動物の角膜を生理食塩水(0.9%NaCl)で30〜60秒ごとに洗浄します。
   3. 手術中と同じ方法でミニピッグを手術台に置きます(図2B、C、図3A)。主な要件は、ヘッドをOCTデバイスのスキャンピースに対して垂直に側面に配置することです。動物の鼻の下に発泡スチロールのパッドを使用して頭を安定させ、目の表面を水平位置にします。
   4. カラー非散瞳眼底カメラでカラー眼底画像を収集すると、前眼部、網膜、視神経乳頭を記録できます。さらに、非散瞳眼底カメラで網膜の赤のない画像を撮ります。
   5. スペクトル領域OCTシステムを用いた光干渉断層撮影イメージングを行う。OCTまたは眼底イメージング中に、ミニブタの頭をOCTレンズまたは眼底カメラレンズに向かって手動で傾けて、後網膜の視野と移植領域を最適化します(図2C)。眼底に埋め込まれたキャリアを最適にイメージングするには、OCTデバイスの赤外線反射光をインプラントに焦点を合わせます(図2C)。OCT クロスラインおよび網膜マップ スキャン モードを使用します。
   6. 動物の眼の蓋の下に検査の最後にオフロキサシン眼科用軟膏を塗布する。
   7. ミニブタを屋内施設に移動し、鎮静が終了するまで(約2時間から5時間)その一般的な状態を観察します。

6.安楽死後の眼の摘出

1. TKX混合物の筋肉内注射とそれに続く1%プロポフォール(20 mL /動物)の静脈内(22 G耳カニューレによる)ボーラス適用とそれに続く放血でミニブタを鎮静させます。.一般的な固定剤は使用しないでください。
2. 細胞移植移植後7日、14日、28日、および42日の深部全身麻酔中に放血によって動物を屠殺する。
3. 鉗子とはさみを使用して、上まぶたと下まぶたを取り外します。3番目のまぶたを外し、結膜を切ります。目の筋肉と視神経を切断します。
4. 外科用ハサミと外科用鉗子を使用して死後に目を除核します。手順が経験豊富な人によって実行されることを確認してください。

Discussion

異なる起源を有するRPE細胞の網膜下移植は、AMD 3,4,8,9,10,11,12,13,14,15,25などの網膜変性疾患の治療のための眼科研究における非常に有望な傾向である.このアプローチの主なアイデアは、損傷したRPEをex vivoで培養された健康なRPEで置き換えることです(補足ファイル1)⁴⁴、45、46、^47、48。培養したRPE細胞を移植するための細胞キャリアの使用は、多孔質膜が偏光RPE細胞層を光感覚層に対して正しい方向に維持するため、最も合理的なアプローチです。

最適動物モデル
このような治療アプローチを開発する上で重要なステップは、最適な動物モデル⁴⁹の使用である。過去には、ウサギ、イヌ、ブタ、および非ヒト霊長類を含む小型および大型動物モデルが使用されてきた⁸、^9、10、11、12、13、¹⁴、¹⁵、^27、29。この論文では、Liběchovミニブタモデルの使用を提案し、堅牢な移植効果を可能にする術前、外科的、および術後のステップについて説明します。Liběchovミニブタはもともと約20年前に飼育され、パーキンソン病やハンチントン病などの神経変性疾患の分野で生物医学研究で頻繁に使用されてきました^29,50。ブタはヒトと同様の血液供給と免疫学的応答を持つ比較的大きな脳を持っているため、同種移植実験の動物モデルとしても使用されています51,52,53,54。ミニブタの網膜は、ヒトのような黄斑および中心窩を有していないが、高濃度の錐体光受容体³⁰を有する網膜の領域である領域中心筋および視覚筋を含む。人間の目と同様のサイズ、錐体が豊富な中枢網膜の存在、よく説明されている免疫系、および手術後の形態と機能を評価する方法の存在は、提示された研究でこの大型動物モデルを使用するための重要な議論です。

手術
我々の知る限り、担体上のRPE細胞の硝子体網膜移植のための標準化され広く受け入れられている外科的技術はありません。細胞補充療法の重要な課題の1つは、網膜剥離、低張、強膜上膜、脈絡膜、および/または網膜出血に関連する術中および術後の合併症のリスクを伴う困難な手術技術であり、足場損傷につながる可能性があります。術後、増殖性硝子体網膜症、眼内炎、低張、網膜剥離、白内障形成のリスクがあります4,10,13,14,15。

細胞キャリアを使用するアプローチに関する最初の研究は、チンチラ野郎ウサギで行われました¹³、^16、25。これらの動物は小動物モデルであるが、手術の技術的側面に焦点を当てた結果は、大型動物モデルにおける手技の開発において重要であるため、以下に要約する。

ジェット気流をリダイレクトするために、カスタムメイドの23 G注入カニューレが最初に2つのサイドポートで使用され、ブレブの崩壊とその結果としての網膜剥離を解決するのに役立ちました¹³。本研究では、このようなブレブの崩壊は認められなかった。その理由として考えられるのは、眼球のサイズが大きく、カニューレ注入部位の末梢に硝子体を温存したコア硝子体切除術のパフォーマンスであり、指向性ジェット気流の力を低下させる可能性があります。

器具からの細胞キャリアの排出中の困難は、「器具に閉じ込められた」と分類された小動物モデルにおける別の術中の障害でした。さらに、著者らは、網膜表面に硝子体が残っているため、移植後に網膜切開口からキャリアが後方に「ジャンプ」する可能性があることを示唆しています。この問題は、網膜下腔への細胞キャリアのスムーズで連続的な排出を可能にする酵素支援硝子体切除術で解決できます。ほとんどの場合、著者らは、網膜切開術から離れたインプラントのより遠い位置を取得するためにキャリアを再配置した。私たちのケースシリーズでは、セルキャリアがインジェクターの先端に取り付けられたままになる状況も経験しました。しかし、それはライトパイプとインジェクターの先端をゆっくりと穏やかに操作することによって管理されていました。いずれの症例においても網膜切開部位に硝子体の残存は認められなかった.手術におけるTA支援PPVの使用は、硝子体の残留付着のリスクを低減する方法として提案できます。TAによる多重染色は、上にある硝子体を完全に除去するために必要であり得る。

別の研究では、ポリエステル膜上に偏光細胞単層として増殖したヒトRPE幹細胞の網膜下移植の結果が報告された²⁴。実験中、前述の同じ外科的手法が使用されましたが¹³、2ポートPPVアプローチが適用されました。最後に、ウサギにおける細胞キャリア手術の網膜下移植のための段階的なプロトコルがその後発表されました²⁵。この研究は、以前の経験にも基づいた術前および術後のケアを含む、外科的処置の非常に詳細で簡単に再現可能な説明を提示します。

その後の研究では、大型動物モデルの使用中に、技術的な質問だけでなく、移植細胞に対する免疫反応に関する質問、および細胞キャリアのサイズに関連する問題も取り上げられました。カニクイザル(Macaca fascicularis)を用いた研究は、ヒト幹細胞由来RPE単層の網膜下移植の結果を記載した¹⁵。すべての動物は、手術の7日前から手術後3か月間続くシロリムス(負荷用量2 mg、1日用量1 mg)とテトラサイクリン(7.5 mg / ^kg-BW )からなる全身免疫抑制を受けました。外科的処置は、前述のプロトコール^24、25に従って実施した。著者らは、シャンデリアエンドイルミネーションを備えた25Gの3ポートPPVアプローチを使用しました。重要なことに、TA支援PVDを使用して、後網膜上の硝子体網膜癒着を除外しました。最初に説明した手順に加えて、著者らは、20 Gのカスタムメイドの拡張可能なループ機器を使用して、将来の移植の領域でホストRPE層を除去しました。

私たちのミニブタの研究では、全身免疫抑制も使用しました。しかしながら、免疫抑制の種類は上記のものとは異なる。タクロリムス溶出ポリマーミクロスフェアをデポーとして0.25 mg/kg BWの用量で皮下注射し、細胞移植片拒絶反応と炎症反応を抑制しました。手術中に宿主RPE細胞層を除去しなかったのは、主な目的は移植された細胞の安全性と生存率を分析することであり、宿主網膜への組み込みを分析することではなかったためです。

これまで、折り畳み式の非分解性メッシュ支持サブミクロンパリレンC膜(6.25 mm x 3.5 mm、厚さ0.4 μm)にhESC由来のRPEの単層を網膜下移植することの安全性と実現可能性を、ユカタン州の雌ミニブタ14頭で評価しました¹⁰。培養後、細胞をメッシュ支持膜上に播種した。免疫抑制は、タクロリムスの全身投与(レジームおよび用量は示されていない)および手術終了時の0.7mgのデキサメタゾンインプラントの硝子体内注射を用いて行われた。PPVは20Gアプローチで実施されました。著者らは、硝子体のより良い視覚化のためにトリアムシノロンアセトノイドの硝子体内注射を使用しました。大硬化切開術は2mmから3mmの大きさであった。網膜下注射後、網膜をペルフルオロカーボン液の一時的な注入で平らにした。流体-空気交換後、シリコーンオイルタンポナーデ(1,000/5,000 cSt)を実施した。術後ケアには、術後1週間のデキサメタゾン/ネオマイシン/ポリミキシンB軟膏の眼内塗布が含まれていました。著者らは、91%の成功率(すなわち、効率的な網膜下移植および十分な術後画像データ)を報告した。本研究では,TA結晶の硝子体内注射を術中,主に硝子体の可視化に用いた.しかしながら、この薬物の局所免疫抑制作用は不明のままである。本研究で用いたナノファイバー状細胞担体は、厚さ5.2 mm x 2.1 mm、厚さ3.7 μm、孔径0.4 μmであった。手術中はパーフルオロカーボン液を注入する代わりに直接FAXを施行した.私たちの外科的成功率(93.1%)は、Kossらのそれと一致し、わずかに優れていました¹⁰。

網膜下移植のための完全分解性細胞キャリア(足場)の網膜下移植は、2019年にヨークシャーブタで最初に研究されました¹⁴。この研究は主にフィブリンヒドロゲルインプラントの生分解性特性に焦点を当てていました。著者らは、家畜豚に使用された積極的な免疫抑制が、フィブリンヒドロゲルインプラントの生分解中に引き起こされる可能性のある局所炎症反応を阻害する可能性があると指摘した。しかし、彼らはブタに使用される免疫抑制療法を特定しなかった。PPVでは、網膜下移植装置を辺縁部と平行に約3.5mm後方に挿入するために、長さ3.6mmの強膜切開術を行った。さらに、指の操作によって引き起こされる手の配置の不安定さを軽減することを目的とした空気圧駆動の噴射システムを使用しました。私たちのケースシリーズでは、すべての硬化切開は辺縁部から2.5mmから3.0mmでした。インジェクター挿入のための大硬化切開術は3mmの長さであった。本研究で使用した植込みインジェクターは手で操作した。毛様体扁平骨の徹底的な焼灼と大硬化切開術内の十分な切断は、医原性末梢網膜剥離、出血、インプラントの喪失などの術中合併症を回避するために重要であると考えられています。

要約すると、遺伝性および後天性網膜疾患の治療選択肢として、生分解性担体へのRPE細胞の移植のためのLiběchovミニブタモデルの使用について説明します。眼の解剖学および生理学、ならびに免疫系に関する類似性により、ヒトの眼疾患の治療に容易に移行することができる細胞の網膜下移植のための外科的技術および器具を開発し改善することができる。ミニブタの手術は、人間の手術で利用する場合、同じ器具(着床送達ツールを含む)を使用して行われるようにし、得られた経験とノウハウを人間に適用しやすくすることが重要です。非ヒト霊長類などの黄斑領域が存在する代替の大眼動物モデルは、網膜中央領域への網膜下移植後の解剖学的および機能的変化の追跡および分析に役立つ可能性があります。術前、外科、および術後のケア手順の詳細な説明は、効率的で標準化されたデータ生成を増やすことにより、将来の研究に役立ちます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Technical equipment
Wato EX-65 with a Mindray iMEC10	Mindray, Shenzhen, China	Wato Ex-65	anesthesia machine
R-Evolution CR	Optikon, Rome, Italy	R-Evolution CR	phacoemulsifier/vitrectome
Green laser Merilas 532α	Meridian, Thun, Switzerland	Merilas 532α	ophthalmic green laser
Microscope Hi-R NEO 900A	Haag-Streit Surgical, Wedel, Germany)	Hi-R NEO 900A	ophthalmic surgery microscope
Camera Sony PMW-10MD	Sony, Tokyo, Japan	PMW-10MD	full HD medical 2-piece
Non-contact vitreoretinal surgical system MERLIN BIOM	Volk, Mentor, OH, USA	MERLIN BIOM	BIOM
Steam sterilizer	Tuttnauer Europe B.V., Breda, NL	3870 HSG	sterilizer
iCam100	Optovue, Fremont, CA, USA	iCAM100	funduscamera
iVue OCT100-2	Optovue, Fremont, CA, USA	iVue OCT100-2	OCT
Microsurgical instruments and devices
Cook Eye Speculum	Katena, New Jersey, US	K1-5403	15mm blades
Ophthalmology surgical drape	Hylyard, Alpharetta, Georgie, USA	79304	132 x 142cm
Disposable Two step vitrectomy system. (23 gauge/ 0.6 mm)	DORC, Zuidland, Netherlands	1272.ED06
Infusion line for 23G / 0.6 mm infusion cannula	DORC, Zuidland, Netherlands	1279.P
knife 2.75mm, IQ Geometry Tm Slit Knife Angled, Bevel Up	Surgical Specialties Corporation, Reading, USA	72-2761G
Extendible 41G subretinal injection needle. (23 gauge / 0.6 mm)	DORC, Zuidland, Netherlands	1270.EXT
Omnifix 3ml Luer Lock Solo siringe	BBraun, Melsungen, Germany	4617022V	3ml
1ml soft-inject Tuberculin	Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany	5010.200V0	1ml
8-0 Coated Vicryl	Ethicon, Puerto Rico, USA	J409G
Purified Silicone Oil (in syringe) 10 ml	(FCI, Paris, France)	S5.7170	1000cSt
Pinnacle 360 Morris Vertical Scissors 23Ga	Synergetics, O'Fallon, USA	10.24.23PIN	23Ga
Revolution DSP 23Ga ILM forceps	Alcon, Geneva, Switzerland	706.44	Griesharber revolution
23ga Straight Laser Probe	Synergetics, O’Fallon, USA	55.21.23
FCI Protect 2.0%	FCI Ophthalmics, Paris, France	S5.9100	viscoelastic
DK Westcott style Stitch Scissors, Curve	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	1-501	Curve
Pierse Notched Forceps, 0,3mm Straigh	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	2-100-1E	0,3mm straigh
DK Harms-Tubingen Straight Tying Forceps	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	2-504E	6mm
DK Needle Holder, Straigh	Duckworth & Kent, Hertfordshire, England	3-201	9mm straigh
Medications and solutions
Unitropic 1% gtt.	UNIMED PHARMA spol. s r.o., Bratislava, Slovak republic	tropicamidum 10 mg/ml	eye drops
Diprophos	Merck Sharp & Dohme B.V., Haarlem, Netherlands	betamethasonum 7 mg/ml	1ml
Alcon BSS Irrigation Solution	Alcon, Geneva, Switzerland	balance salt solution (BSS)	500ml
Betaisodona	Mundipharma, Cambridge, United Kingdom	povidon-Iodine 1g/10ml	30ml
Depo-medrol 120mg	Pfizer, New Yourk, USA	methylprednisolon	5ml/200mg
Shotapen	Virbac Carros Cedex, France	benzylpenicillin, dihydrostreptomycin	250ml
Flunixin a.u.v.	Norbrook, Newry, Northern Ireland	flunixinum 50,0 mg	250ml
Tramal 100MG/2ML	Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland	tramadol	2ml
Zoletil 100	Virbac Carros Cedex, France	tiletamine, zolazepam	100mg
Narkeran 10	Vetoquinol, Magny-Vernois, France	ketamin	2ml
Rometar 20mg/ml	Spofa pharmaceutica, Prague, Czech republic	xylazinum	20mg
Braunol 75mg/g	B.Braun medical, Prague, Czech republic	povidone iodine	75mg/g
Propofol 1% MCT/LCT	Fresenius Kabi, Bad Homburg, Deutschland	propofol	10mg/1ml
Isoflurane 100% Inhalation vapour, liquid	Piramal Critical Care Limited, West Drayton, United Kingdom	isoflurane	100%
Benoxi gtt.  4mg/1ml	Unimed pharma, Bratislava, Slovakia	oxybuprakaine	10ml
Neosynephrin POS 10% gtt.	Ursapharm , Saarbrücken, Deutschland	fenylefrin chloride	10ml
Ophthalmo-framykoin 1X5GM	Zentiva a.s.,  Prague, Czech republic	bacitracin zinc/hydrocortisone acetate/hydrocortisoneacetate/neomycin sulfate	5mg
Floxal ung.	Dr. Gerhard Mann Chem.-Pharm. Fabrik, Berlin, Germany	ofloxacin	0.30%
Eficur inj.	Hipra, Amer, Spain	ceftiofurum hydrochloridum	50mg / 1ml
Draxxin	Zoetis Inc., New Jersey, USA	tulathromycinum	100mg / 1ml
Tramal	Stada Arzneimittel AG, Bad Vilbel, Deutschland	tramadoli hydrochloridum	100mg / 2ml
Xylapan	Vetoquinol, Magny-Vernois, France	xylazinum	0.4 mg/kg
Proparacaine hydrochlorid ophthalmic solution 0,5%	Bausch&Lomb Incorporated Tampa, FL, USA	Proparacaine hydrochlorid	0.50%
Prograf	Astellas Pharma, Deerfield, Illinois, USA	Tacrolimus powder	1mg
Cell carrier, cultivated cells cultures, and implantation injector
Falcon Cell Culture Inserts	Corning Inc., Kenneburg, ME, USA	353103
TrypLE Express Enzyme (1X)	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	12604021
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	11320033
Biolaminin 521 LN (LN521)	BioLamina, Sundbyberg, Sweden	LN521-02
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	35050061
2-Mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific, MA, USA	J66742.0B
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Mi, USA	P4333
CRALBP	Novus Biologicals, Abingdon, UK	NB100-74392
Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific, Germany	21202