JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Bioengineering

Biomoleculaire beeldvorming van cellulaire opname van nanodeeltjes met behulp van multimodale niet-lineaire optische microscopie

Published: May 16th, 2022

DOI:

10.3791/63637

1Biomedical Physics, School of Physics and Astronomy, University of Exeter
* These authors contributed equally

Dit artikel presenteert de integratie van een spectrale focusmodule en een dual-output pulslaser, waardoor snelle hyperspectrale beeldvorming van gouden nanodeeltjes en kankercellen mogelijk wordt. Dit werk is bedoeld om de details van multimodale niet-lineaire optische technieken te demonstreren op een standaard laserscanmicroscoop.

Het onderzoeken van gouden nanodeeltjes (AuNP's) in levende systemen is essentieel om de interactie tussen AuNP's en biologische weefsels te onthullen. Bovendien, door niet-lineaire optische signalen zoals gestimuleerde Raman-verstrooiing (SRS), twee-foton geëxciteerde fluorescentie (TPEF) en transiënte absorptie (TA) in een beeldvormingsplatform te integreren, kan het worden gebruikt om biomoleculair contrast van cellulaire structuren en AuNP's op een multimodale manier te onthullen. Dit artikel presenteert een multimodale niet-lineaire optische microscopie en past deze toe om chemisch specifieke beeldvorming van AuNP's in kankercellen uit te voeren. Dit beeldvormingsplatform biedt een nieuwe benadering voor het ontwikkelen van efficiënter gefunctionaliseerde AuNP's en het bepalen of ze zich in vasculatuur rond de tumor, pericellulaire of cellulaire ruimtes bevinden.

Gouden nanodeeltjes (AuNP's) hebben een groot potentieel getoond als biocompatibele beeldvormingsondes, bijvoorbeeld als effectieve oppervlakte-verbeterde Raman-spectroscopie (SERS) substraten in verschillende biomedische toepassingen. Belangrijke toepassingen zijn gebieden zoals biosensing, bioimaging, oppervlakte-verbeterde spectroscopieën en fotothermische therapie voor kankerbehandeling1. Bovendien is het onderzoeken van AuNP's in levende systemen cruciaal voor het beoordelen en begrijpen van de interactie tussen AuNP's en biologische systemen. Er zijn verschillende analytische technieken, waaronder Fourier transform i....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Het lasersysteem inschakelen

  1. Schakel het vergrendelingssysteem in en selecteer de armlaser voordat u het systeem start.
  2. Schakel de pc in met de software om de femtosecondelaser met dubbele uitgang te bedienen.
  3. Laad de software voor de femtoseconde laser met dubbele uitgang; deze software maakt het mogelijk om de laser aan en uit te schakelen en regelt direct de golflengte van de pompstraal.
  4. Schakel de laseremissie in door het aan/uit-pictogram 3 ingedrukt te hou.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De Spectral Focusing Timing and Recombination Unit (SF-TRU) module wordt geïntroduceerd tussen de dual-output femtoseconde laser en de gemodificeerde laserscanmicroscoop. Het instelbare ultrasnelle lasersysteem dat in deze studie wordt gebruikt, heeft twee uitgangspoorten die één straal leveren op een vaste golflengte van 1.045 nm en de andere bundel die instelbaar is in het bereik van 680-1.300 nm. Een gedetailleerd schema van de SF-TRU-module en het multimodale beeldvormingsplatform is weergegeven in

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Deze studie heeft de combinatie van SF-TRU-module en ultrasnel lasersysteem met dubbele uitgang gepresenteerd en zijn toepassingen voor multimodale microspectroscopie gedemonstreerd. Met zijn vermogen om de opname van gouden nanodeeltjes (AuNP's) door kankercellen te onderzoeken, kan het multimodale beeldvormingsplatform de cellulaire reacties op hypertherme kankerbehandelingen visualiseren wanneer laserstralen worden geabsorbeerd door AuNP's.

Bovendien worden snelle chemisch specifieke beeldv.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit onderzoek werd ondersteund door EPSRC Grants: Raman Nanotheranostics (EP/R020965/1) en CONTRAST facility (EP/S009957/1).

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
APE SRS Detection UnitAPE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)APE Lock-in ModuleCombined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations
Confocal Scanning UnitOlympusFV 3000Confocal scanning unit used for imaging
CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µmInvitrogenC37483Polystyrene microspheres
CoverslipsThorlabsCG15CH222 mm x 22 mm coverslips for seeding cells
FBSGibco10500-064Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)
FlouviewOlympusFV31S-SWLaser scanning microscope control software
Function GeneratorBX precision40543Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam
FV3000OlympusIX83P2ZFOther microscope frames can be used.
Gold NanoparticlesNanopartzA11-60Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter
Input Output InterfaceOlympusFV30 ANALOGThis unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.
InSight X3NewportSpectra-PhysicsDual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.
Microscope FrameOlympusIX83Inverted microscope
Mouse 4T1 cellsATCCCRL-2539Mouse breast cancer cells
NA 1.2 Water Immersion ObjectiveOlympusUPLSAPO60XW/IRThe multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.
NA 1.4 CondenserNikonCSC1003Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.
PMTHamamatsuR3896PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy
PMT ConnectorHamamatsuC13654-01-Y002Connector for PMT
Power SupplyRSRSPD-3303 CProgrammable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT
RPMI-1640GibcoA10491-01Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.
SF-TRUNewport Spectra PhysicsSF-TRUSystem designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS

  1. Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), 1903441 (2020).
  2. Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
  3. Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
  4. Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), 5049-5056 (2015).
  5. Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), 1801735 (2019).
  6. Wang, C. -. C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).
  7. Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
  8. Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
  9. Wang, C. -. C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).
  10. Li, F. -. C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
  11. Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
  12. Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
  13. Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
  14. Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
  15. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  16. Wang, C. -. C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).
  17. Wang, C. -. C., Yoong, F. -. Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).
  18. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  19. Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).
  20. Wang, C. -. C., Wu, R. -. J., Lin, S. -. J., Chen, Y. -. F., Dong, C. -. Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).
  21. Wang, C. -. C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).
  22. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  23. Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).
  24. Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
  25. Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved