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Bioengineering

マルチモーダル非線形光学顕微鏡を用いたナノ粒子の細胞取り込みの生体分子イメージング

Published: May 16th, 2022

DOI:

10.3791/63637

1Biomedical Physics, School of Physics and Astronomy, University of Exeter
* These authors contributed equally

本稿では、スペクトル集束モジュールとデュアル出力パルスレーザーを統合し、金ナノ粒子と癌細胞の高速ハイパースペクトルイメージングを可能にする方法について説明します。この研究は、標準的なレーザー走査型顕微鏡でマルチモーダル非線形光学技術の詳細を実証することを目的としています。

生体系における金ナノ粒子(AuNP)の調査は、AuNPと生体組織との相互作用を明らかにするために不可欠です。さらに、誘導ラマン散乱(SRS)、2光子励起蛍光(TPEF)、過渡吸収(TA)などの非線形光信号をイメージングプラットフォームに統合することで、細胞構造とAuNPの生体分子コントラストをマルチモーダルに明らかにすることができます。本稿では、マルチモーダル非線形光学顕微鏡法を紹介し、それを応用して癌細胞におけるAuNPの化学的特異的イメージングを実行します。このイメージングプラットフォームは、より効率的に機能化されたAuNPを開発し、それらが腫瘍、細胞周囲、または細胞空間を取り巻く血管系内にあるかどうかを判断するための新しいアプローチを提供します。

金ナノ粒子(AuNP)は、生体適合性イメージングプローブとして、例えば、さまざまな生物医学的用途における効果的な表面増強ラマン分光法(SERS)基板として大きな可能性を示しています。主な用途としては、バイオセンシング、バイオイメージング、表面増強分光、がん治療のための光熱療法などの分野が挙げられます1。さらに、生命系におけるAuNPの調査は、AuNPと生体系との相互作用を評価および理解するために重要です。フーリエ変換赤外(FTIR)分光法2、レーザーアブレーション誘導結合質量分析法(LA-ICP-MS)3、磁気共鳴画像法(MRI)4など、さまざまな分析技術を使用して組織内のAuNPの分布を調べることに成功しています。それにもかかわらず、これらの方法は、時間がかかり、複雑なサンプル調製を伴う3、長い取得時間を必要とする、またはサブミクロンの空間分解能の欠如2,4など、いくつかの欠点を抱いています。

従来のイメージング技術と比較して、非線形光学顕微鏡は生細胞とAuNPをプロービングする....

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1.レーザーシステムのスイッチを入れる

  1. システムを起動する前に、インターロックシステムのスイッチを入れ、アームレーザーを選択してください。
  2. ソフトウェアを使用してPCの電源を入れ、デュアル出力フェムト秒レーザーを制御します。
  3. デュアル出力フェムト秒レーザーのソフトウェアをロードします。このソフトウェアにより、レーザーの電源のオ?.......

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スペクトル集束タイミングおよび再結合ユニット(SF-TRU)モジュールは、デュアル出力フェムト秒レーザーと修正レーザー走査型顕微鏡の間に導入されます。この研究で使用された調整可能な超高速レーザーシステムには、1つのビームを固定1,045 nmの波長で提供し、もう1つのビームを680〜1,300 nmの範囲で調整可能な2つの出力ポートを備えています。SF-TRUモジュールとマルチモーダルイメージン?.......

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本研究では、SF-TRUモジュールと超高速デュアル出力レーザーシステムの組み合わせにより、マルチモーダル顕微分光法への応用を実証しました。マルチモーダルイメージングプラットフォームは、がん細胞による金ナノ粒子(AuNP)の取り込みを調査する機能により、レーザービームがAuNPに吸収された場合の温熱がん治療に対する細胞の応答を視覚化できます。

さらに、2組.......

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この研究は、EPSRC Grants: Raman Notheranostics (EP/R020965/1) および CONTRASTファシリティ (EP/S009957/1) の支援を受けた。

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
APE SRS Detection UnitAPE (Angewandte Physik & Elektronik GmbH)APE Lock-in ModuleCombined system containing a large area Si photo-diode for detecting the pump beam along with a Lock-In amplifier for detecting the beam modulations
Confocal Scanning UnitOlympusFV 3000Confocal scanning unit used for imaging
CML Latex Beads, 4% w/v, 1.0 µmInvitrogenC37483Polystyrene microspheres
CoverslipsThorlabsCG15CH222 mm x 22 mm coverslips for seeding cells
FBSGibco10500-064Foetal Bovine Serum (Heat Inactivated)
FlouviewOlympusFV31S-SWLaser scanning microscope control software
Function GeneratorBX precision40543Used to generate square wave function which is fed to EOM in SF-TRU to produce modulations in the stokes beam
FV3000OlympusIX83P2ZFOther microscope frames can be used.
Gold NanoparticlesNanopartzA11-60Spherical gold nanoparticles, 60 nm diameter
Input Output InterfaceOlympusFV30 ANALOGThis unit allows voltage readouts from PMT and LockIn to be fed into the confocal scanning software and allows timing pulses to be sent between the olympus microscope and the SF-TRU unit.
InSight X3NewportSpectra-PhysicsDual-output femtosecond pulsed laser. Tunable (680–1300 nm) and fixed (1045 nm) laser outputs with the repetition rate of 80 MHz.
Microscope FrameOlympusIX83Inverted microscope
Mouse 4T1 cellsATCCCRL-2539Mouse breast cancer cells
NA 1.2 Water Immersion ObjectiveOlympusUPLSAPO60XW/IRThe multiphoton 60x Objective has a 0.28 mm working distance. Other similar objectives can be used.
NA 1.4 CondenserNikonCSC1003Other condensers with NA higher than the excitation objective can also be used.
PMTHamamatsuR3896PMT used for detecting anti-stokes photos for CARS micrsocopy
PMT ConnectorHamamatsuC13654-01-Y002Connector for PMT
Power SupplyRSRSPD-3303 CProgrammable power supply which is used for providing the correct voltage to the PMT
RPMI-1640GibcoA10491-01Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells.
SF-TRUNewport Spectra PhysicsSF-TRUSystem designed for controlling the time delay and dispersion of the 2 laser outputs and for performing the beam modulations required for SRS

  1. Tabish, T. A., et al. Smart gold nanostructures for light mediated cancer theranostics: Combining optical diagnostics with photothermal therapy. Advanced Science. 7 (15), 1903441 (2020).
  2. Tian, F., et al. Gold nanostars for efficient in vitro and in vivo real-time SERS detection and drug delivery via plasmonic-tunable Raman/FTIR imaging. Biomaterials. 106, 87-97 (2016).
  3. Jenkins, S. V., et al. Enhanced photothermal treatment efficacy and normal tissue protection via vascular targeted gold nanocages. Nanotheranostics. 3 (2), 145-155 (2019).
  4. Huang, J., et al. Rational design and synthesis of gammaFe2 O3 @Au magnetic gold nanoflowers for efficient cancer theranostics. Advanced Materials. 27 (34), 5049-5056 (2015).
  5. Dilipkumar, A., et al. Label-free multiphoton endomicroscopy for minimally invasive in vivo imaging. Advanced science. 6 (8), 1801735 (2019).
  6. Wang, C. -. C., et al. Differentiation of normal and cancerous lung tissues by multiphoton imaging. Journal of Biomedical Optics. 14 (4), 044034 (2009).
  7. Chrabaszcz, K., et al. Comparison of standard and HD FT-IR with multimodal CARS/TPEF/SHG/FLIMS imaging in the detection of the early stage of pulmonary metastasis of murine breast cancer. The Analyst. 145 (14), 4982-4990 (2020).
  8. Tsai, T. H., et al. Visualizing radiofrequency-skin interaction using multiphoton microscopy in vivo. Journal of Dermatological Science. 65 (2), 95-101 (2012).
  9. Wang, C. -. C., et al. Early development of cutaneous cancer revealed by intravital nonlinear optical microscopy. Applied Physics Letters. 97 (11), 113702 (2010).
  10. Li, F. -. C., et al. Dorsal skin fold chamber for high resolution multiphoton imaging. Optical and Quantum Electronics. 37 (13), 1439-1445 (2005).
  11. Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nature Nanotechnology. 7 (1), 56-61 (2011).
  12. Chong, S., Min, W., Xie, X. S. Ground-state depletion microscopy: Detection sensitivity of single-molecule optical absorption at room temperature. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1 (23), 3316-3322 (2010).
  13. Chen, T., et al. Transient absorption microscopy of gold nanorods as spectrally orthogonal labels in live cells. Nanoscale. 6 (18), 10536-10539 (2014).
  14. Liu, J., Irudayaraj, J. M. Non-fluorescent quantification of single mRNA with transient absorption microscopy. Nanoscale. 8 (46), 19242-19248 (2016).
  15. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  16. Wang, C. -. C., et al. In situ chemically specific mapping of agrochemical seed coatings using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Biophotonics. 11 (11), 201800108 (2018).
  17. Wang, C. -. C., Yoong, F. -. Y., Penfield, S., Moger, J. Visualization of active ingredients uptake in seed coats with stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings SPIE 10069, Multiphoton Microscopy the Biomedical Sciences XVII. , 1006928 (2017).
  18. Hu, F., Shi, L., Min, W. Biological imaging of chemical bonds by stimulated Raman scattering microscopy. Nature Methods. 16 (9), 830-842 (2019).
  19. Zeytunyan, A., Baldacchini, T., Zadoyan, R. Module for multiphoton high-resolution hyperspectral imaging and spectroscopy. Proceedings SPIE 10498, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XVIII. , 104980 (2018).
  20. Wang, C. -. C., Wu, R. -. J., Lin, S. -. J., Chen, Y. -. F., Dong, C. -. Y. Label-free discrimination of normal and pulmonary cancer tissues using multiphoton fluorescence ratiometric microscopy. Applied Physics Letters. 97 (4), 043706 (2010).
  21. Wang, C. -. C., Chandrappa, D., Smirnoff, N., Moger, J. Monitoring lipid accumulation in the green microalga botryococcus braunii with frequency-modulated stimulated Raman scattering. Proceedings SPIE 9329, Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences XV. , 9329 (2015).
  22. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  23. Cui, L., et al. In situ plasmon-enhanced CARS and TPEF for Gram staining identification of non-fluorescent bacteria. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 264, 120283 (2022).
  24. Ma, J., Sun, M. Nonlinear optical microscopies (NOMs) and plasmon-enhanced NOMs for biology and 2D materials. Nanophotonics. 9 (6), 1341-1358 (2020).
  25. Sun, L., Chen, Y., Sun, M. Exploring nonemissive excited-state intramolecular proton transfer by plasmon-enhanced hyper-Raman scattering and two-photon excitation fluorescence. The Journal of Physical Chemistry C. 126 (1), 487-492 (2022).

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