Robust och mycket reproducerbar generation av kortikala hjärnorganoider för modellering av hjärnans neuronala åldrande in vitro

I denna studie tillhandahåller vi en detaljerad teknik för ett enkelt men robust kortikalt organoidodlingssystem med standardmatarfria hPSC-kulturer. Detta är ett snabbt, effektivt och reproducerbart protokoll för att generera organoider som modellerar aspekter av hjärnans åldrande in vitro.

Hjärnorganoider är tredimensionella modeller av den utvecklande mänskliga hjärnan och ger en övertygande, banbrytande plattform för sjukdomsmodellering och storskalig genomisk och läkemedelsscreening. På grund av den självorganiserande naturen hos celler i hjärnorganoider och det växande utbudet av tillgängliga protokoll för deras generation har problem med heterogenitet och variation mellan organoider identifierats. I detta protokollpapper beskriver vi ett robust och replikerbart protokoll som till stor del övervinner dessa problem och genererar kortikala organoider från neuroektodermala förfäder inom 1 månad, och som kan bibehållas i mer än 1 år. Detta mycket reproducerbara protokoll kan enkelt utföras i ett vanligt vävnadsodlingsrum och resulterar i organoider med en rik mångfald av celltyper som vanligtvis finns i den utvecklande mänskliga cortexen. Trots deras tidiga utvecklingsmakeup kommer neuroner och andra mänskliga hjärncellstyper att börja uppvisa de typiska tecknen på åldrande i neuronala celler efter långvarig in vitro-odling , vilket gör dem till en värdefull och användbar plattform för att studera åldrande-relaterade neuronala processer. Detta protokoll beskriver också en metod för att detektera sådana åldrande celler i kortikala hjärnorganoider med hjälp av åldrande-associerad beta-galaktosidasfärgning.

Vår nuvarande kunskap om den mänskliga hjärnan har till stor del baserats på djurmodeller och obduktion av hjärnprover. Stamcellsbiologi är ett snabbt framåtskridande område som ger nya insikter i den grundläggande biologin för mänsklig hjärnutveckling och de patologiska drivkrafterna för mänskliga hjärnsjukdomar. Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) är ett ovärderligt verktyg för att modellera den mänskliga hjärnan via generering av organoider, organliknande tredimensionell (3D) vävnad som vanligtvis rekapitulerar utvecklingsbanorna, cellulär smink och arkitektur i den utvecklande mänskliga hjärnan. Hjärnorganoider är självmonterade och består av neurala stamceller, specificerade neurala förfäder, mogna neuroner och glialcelltyper. Organoider ger därför en unik möjlighet att studera den tidiga mänskliga hjärnan, som ofta är otillgänglig för direkta experiment men också har inneboende begränsningar som frånvaro av kärl och ett immunsystem.

Metoder för att generera hjärnorganoider har drivits på två olika sätt: ostyrd och guidad differentiering. Ostyrda hjärnorganoidmetoder förlitar sig på den spontana inneboende differentieringskapaciteten hos stamcellerna som driver vävnadsmorfogenes ^1,2 och möjliggör framväxten av en mängd olika cellinjeidentiteter som sträcker sig från framhjärna, mellanhjärna och bakhjärna till koroidplexus, näthinna och mesoderm. Däremot kräver styrda hjärnorganoidmetoder betydande användning av externa faktorer för att driva hPSCs mot önskad mönstring av neuronala linjer som representerar en hjärnregiontyp, såsom medial ganglionic eminens³, framhjärna⁴, midbrain⁵, hypotalamus⁶, cerebellum⁷ och choroid plexus⁸. Denna förmåga att generera olika hjärnregioner med olika cellinjer, och potentialen att smälta samman dessa efter behag, gör hjärnorganoider till en utmärkt modell för att undersöka mänsklig hjärnutveckling och dechiffrera de underliggande mekanismerna för hjärnrelaterade sjukdomar. Även om dessa metoder för att generera hjärnorganoider erbjuder ett genombrott i modellering av mänskliga hjärnregioner, är variationen och heterogeniteten mellan organoider fortfarande en betydande begränsning för systematiska och kvantitativa studier, såsom läkemedelsscreening.

Det nuvarande protokollet är baserat på en metod som utvecklats i vår senaste artikel⁹ och involverar selektiv differentiering av hPSC-kolonier mot neuroektoderm (NEct) identitet med dubbla SMAD-hämmare (SB-431542 och LDN 193189), som sedan har förmågan att självorganisera inom 4 dagar till 3D-neuroepitelsfäroider under påverkan av FGF2-signalering. Dessa neuroepitelsfäroider genererar på ett tillförlitligt sätt homogena kortikala organoider med en in vivo-liknande cellulär komposition inom 4 veckor efter differentiering. Protokollet som beskrivs här bygger på våra tidigare resultat som visar att hämning av dubbla SMAD -signalering (Suppressor of Mothers Against Decapentaplegic) främjar differentieringen av hPSCs mot rostrala neurala stamceller härledda från neuroektodermala förfäder¹⁰ genom att bland annat hämma endodermal, mesodermal och trophectoderm cell fate choice¹¹ . Vidare utlöser inbäddningen av neuroepitelsfäroiderna i den hESC-kvalificerade källarmembranmatrisen signifikant spirande av neuroepithelia och bildar ventriklar med apikobasal polaritet. Storskalig odling visade reproducerbarhet och homogenitet hos kortikala organoider oberoende av cellinjer, kloner eller satser, och representerar därmed ett tillförlitligt och stabilt stamcellssystem för att efterlikna tidig mänsklig kortikal utveckling inom hälsa och sjukdom in vitro. Vi beskriver vidare ett protokoll för att detektera senescenta neuronala cellmarkörer i hPSCs-härledda kortikala hjärnorganoider som har odlats under längre tidsperioder.

Efter plätering av hPSCs vid en sådddensitet på 20% -30% behandlas cellerna med dubbla SMAD-hämmare i 3 dagar för att differentiera hPSC-kolonier mot neuroektodermala kolonier. Dessa kolonier lyfts sedan försiktigt med dispas och sås in i ultralåga 6-brunnsplattor kompletterade med FGF2. De flytande 2D-kolonierna självorganiserar sig i 3D-neuroektodermala sfäroider över natten och upprätthålls i 4 dagar i N2-medium kompletterat dagligen med FGF2. När sfäroiderna har etablerat det neuroepiteliella skiktet kan de bäddas in i källarmembranmatrisen. Genom att rutinmässigt lägga till färskt terminalt differentieringsmedium kommer forskarna att observera progressiv expansion och spirande av neuroepithelia i kortikala organoider. Forskare kanske vill dissociera dessa organoider för att genomföra transkriptionell och proteomisk profilering. Dessutom rekommenderas ljusfältsavbildning för övervakning av kvaliteten på de kortikala organoiderna. Analys kan utföras genom fixering, kryosektion och immunfärgning. Beskrivningar och metoder för dessa tekniker har tidigare beskrivits¹². I slutändan tillåter detta protokoll forskare att snabbt och robust generera homogena kortikala hjärnorganoider för modellering av den utvecklande mänskliga kortikala hjärnan, med låg kostnad och begränsad utrustning, och för att studera aspekter av cellulär neuronal åldrande, som beskrivs i detta papper.

1. Kortikala hjärnorganoider generation

OBS: Alla steg i detta avsnitt av protokollet kommer att ske i en klass 2 biosäkerhetskåpa, om inte annat anges.

1. Induktion av 2D neuroektodermala kolonier från hPSC 2D-kultur (dagar -1 till 3)
   1. Före induktion, platta hPSC-kolonierna på en hESC-kvalificerad källarmembranmatris i en 6-brunnsplatta med 20% -30% densitet. Uppnå denna densitet genom att passera hPSC-kolonier från en brunn på en 6-brunnsplatta vid 60% sammanflöde till tre brunnar i en 6-brunnsplatta.
   2. För källarmembranmatrisbeläggning, späd källarmembranmatrisen i ett förhållande av 1:50 i ett vanligt basalmedium. Sätt jämnt 1 ml / brunn på en 6-brunnsplatta, inkubera i 1 timme vid rumstemperatur (RT) och aspirera sedan.
   3. Behåll hPSC-kolonier i 1 dag i 2 ml av ett serumfritt cellodlingsmedium före differentiering.
   4. På dagen för hPSC-differentiering, inspektera hPSC-kolonierna med hjälp av ljusfältmikroskopi vid 4x till 10x förstoring för att säkerställa friska kolonier utan detekterbar differentiering.
      OBS: Friska hPSCs kommer att bilda täta kantkolonier med celler som har en stor kärna, mycket liten cytoplasma och framträdande nukleoler. Differentierade iPSC-kolonier kommer att uppvisa tydliga morfologiska skillnader jämfört med de beskrivna hPSC-kolonierna ovan, särskilt runt koloniernas ytterkanter eller i mitten.
   5. Tillsätt reagenser som förtecknas i tabell 1 för att utgöra det N2-medium som krävs för differentiering. Ta detta medium till RT före användning.
   6. En gång vid RT, aspirera det serumfria cellodlingsmediet från varje brunn på 6-brunnsplattan och ersätt med 2 ml N2-medium försiktigt tillsatt med en 5 ml serologisk pipett.
   7. Lägg till de dubbla SMAD-hämmarna, SB-431542 (10 μM) och LDN 193189 (100 nM).
      OBS: SMAD-hämmarna kan tillsättas till N2-mediet efter att mediet har placerats i varje brunn, eller till den erforderliga mängden N2-medium innan det serumfria cellodlingsmediet ersätts. Hämmare kan införlivas jämnt i mediet genom att försiktigt virvla plattan eller invertera röret som innehåller mediet och hämmarna 3-4 gånger.
   8. Tillsätt färska N2-medier kompletterade med SB-431542 (10 μM) och LDN-193189 (100 nM) dagligen till varje brunn under de kommande 2 dagarna.
      OBS: Färskt N2-medium tillsätts för att minska den långvariga exponeringen av celler för DMSO som används för att lösa upp SB-431542 och LDN 193189 föreningar och förhindra cytotoxicitet.
2. Generering av 3D-neuroektodermala sfäroider från inducerade 2D-neuroektodermala kolonier (dag 3 till 7)
   1. Lyft de inducerade neuroektodermala kolonierna med dispas enligt steg 1.2.2-1.2.8.
   2. Ta först bort 2 ml N2-medium från 6-brunnsplattan och tvätta 1x med HBSS för att säkerställa att allt N2-medium tas bort.
      OBS: N2-medium kan störa enzymaktiviteten hos dispas, vilket förhindrar adekvat avlägsnande av neuroektodermala kolonier från brunnen.
   3. Tillsätt 1 ml 2,4 enheter / ml dispase till varje koloniinnehållande brunn.
   4. Inkubera brunnen i 20-25 min (max 30 min) vid 37 °C. Kontrollera om det finns koloniavlossning regelbundet.
      OBS: Små kolonier kan lossna inom 20 minuter. Alla kolonier som sitter fast efter 30 min bör ignoreras.
   5. Efter inkubation, tillsätt 1 ml N2-medium till brunnen för att stoppa aktiviteten hos dispasenzymet och överför kolonierna till ett 15 ml rör med en bredborrad P1000-pipettspets eller en modifierad P1000-pipettspets skuren med steril sax (vilket gör den till en bredborrad P1000-spets).
   6. Låt koloniklumparna sjunka till botten av röret med tyngdkraften.
      OBS: Denna process tar cirka 1 min.
   7. När klumparna har sjunkit, ta försiktigt bort supernatanten med en standard P1000-pipettspets och byt ut den mot 1 ml färskt N2-medium. Upprepa detta tvättsteg tre gånger för att säkerställa fullständigt avlägsnande av dispas.
      OBS: Eventuella återstående dispas kommer att förhindra en enhetlig bildning av neuroektodermala sfäroider och inducera celldöd.
   8. Efter tvättning, återsuspendera cellklumparna i 3 ml N2-medium och överför till en brunn av en 6-brunnsplatta och tillsätt 40 ng / ml bFGF.
      OBS: Om ett stort antal neuroektodermala kolonier lossnade, kunde dessa kolonier pläteras över två eller flera brunnar på en 6-brunnsplatta för att förhindra fusion av sfäroider. 24 h efter dispase lossning av kolonierna, kontrollera om sfäroiderna har bildats.
   9. Behåll sfäroiderna i samma media under de kommande 3-4 dagarna men lägg till färsk bFGF (40 ng / ml) till varje brunn dagligen för att främja neuroektodermal cellproliferation, självorganiserande och inducera och expandera neuroepithelia.
      OBS: Om sfäroider har pläterats med högre densitet kommer mediet sannolikt att bli gult och kräva att var 2: e dag ersätts med färsk bFGF (40 ng / ml). Detta rekommenderas dock inte, och istället bör ett lägre antal sfäroider bibehållas i varje brunn för att undvika detta problem. Sfäroider kan inbäddas i källarmembranmatrisen efter 3 dagar om neuroepithelia är uppenbara. Om neuroepithelia inte är uppenbara eller inte ser starka ut, behåll sedan sfäroiderna för en annan dag och kontrollera igen.
3. Kortikal hjärnorganoid differentiering och underhåll (dag 8)
   1. Förbered det terminala differentieringsmediet (DM) med hjälp av de reagenser som anges i tabell 2. Ta med det här mediet till RT.
   2. Tina 100% hESC-kvalificerad källarmembranmatris på is.
   3. Förbered ett ark parafilm med gropar steriliserade med 70% etanol i en 10 cm petriskål och placera den på ett stereomikroskop under en huva.
      OBS: En tom bricka med 200 μL pipettspetsar kan användas för att generera ett rutnät med gropar.
   4. Klipp av änden av en 100 μL pipettspets (för att göra den bredborrad). Detta kommer att användas för att bädda in neurala sfäroider i källarmatrisen utan att bryta dem.
   5. Använd ett stereomikroskop, välj neurala sfäroider av liknande storlek (500 μm) från 6-brunnsplattan och överför dem till parafilm-dimples med hjälp av den bredborrade 100 μL pipettspetsen och placera en enda neural sfäroid per grop.
   6. Ta försiktigt bort överflödigt media och lämna precis tillräckligt för att täcka sfäroiderna.
      OBS: Detta för att bibehålla kvaliteten på sfäroiderna innan du lägger till källarmatrisen och för att säkerställa att de inte torkar ut.
   7. Tillsätt försiktigt 18 μL källarmatris över sfäroiden och placera sfäroiden i mitten av matrisfallet. Använd änden av en 10 μL pipettspets för att centrera sfäroiderna i matrisen.
      OBS: Försök att lägga till källarmatrisen så snabbt som möjligt för att undvika att överflödiga medier runt sfäroiderna torkar ut.
   8. Täck över 10 cm petriskålen och överför den till kuvösen och inkubera parafilmskålen med inbäddade sfäroider i källarmatrisen vid 37 °C i 25 minuter.
   9. Efter inkubation, skölj av de inbäddade sfäroiderna i en låg 24-brunnsplatta med en P1000-spets med 0,5 ml DM-media och se till att enskilda inbäddade sfäroider placeras i en brunn vardera.
      OBS: Om mer än en inbäddad sfäroid faller i en brunn, använd en bredborrad P1000-spets för att överföra den andra sfäroiden till en ny brunn.
   10. Behåll de differentierade kortikala hjärnorganoiderna i DM-mediet under längre perioder, med medieförändringar som inträffar var 2: e dag när organoiderna blir större och äldre.
       OBS: Under den första veckan av differentiering kan mediet ändras var 3: e dag.

2. Karakterisering av neuronal åldrande i kortikala organoider

1. Bearbeta kortikala organoider för kryosektioner:
   OBS: Stegen utfördes i en klass 2 biosäkerhetshuv.
   1. Förbered 2 ml rör, var och en fylld med 1,5 ml 4% paraformaldehyd (PFA).
   2. Skär änden av en P1000-pipettspets (för att göra den till en bredborrning) och överför försiktigt varje organoid till ett av de 2 ml rör som framställts ovan (en organoid per rör).
      OBS: För att förhindra överskott av DM-mediablandning med PFA, låt organoiden sjunka mot öppningen av P1000-pipettspetsen och vila spetsen strax ovanför toppen av PFA i röret innan du pipetterar ut organoiden. Detta gör det möjligt för forskaren att överföra bara organoid och mycket minimal media.
   3. Låt fixeringsprocessen ske vid 4 °C i 1 timme.
   4. Använd en oklippt P1000-pipettspets, aspirera försiktigt överskott av PFA och tillsätt 1,5 ml kall 1x PBS.
   5. Överför rören till en orbitalskakare inställd på 70 rpm i 10 min vid RT.
   6. Upprepa tvättprocessen med kall 1x PBS tre gånger för att säkerställa att all PFA har tagits bort ordentligt.
      OBS: Kassera inte PFA i vanliga avfallsbehållare; förbered istället en specifik behållare för bortskaffande av kemiskt avfall för detta, eftersom PFA är en fara.
   7. Sänk ner organoiderna i 1x PBS innehållande 30 % sackaros och inkubera vid 4 °C tills alla organoider har sjunkit till rörets botten.
      OBS: Den tid som krävs för att låta organoiderna sjunka beror på organoidernas storlek/ ålder. 3 månader gamla organoider kan ta upp till 5 timmar.
   8. Använd en skuren, bredborrad P1000-pipettspets och överför försiktigt tre till fem organoider till en monteringsform som innehåller en monteringslösning gjord av 30% sackaros och 100% optimal skärtemperatur (OCT) medium, i förhållandet 3: 2.
   9. Använd en 10 μL pipettspets med hjälp av ett stereomikroskop för att orientera och placera organoider i ett rutnätliknande mönster.
   10. Placera formen på torris för att stelna SACKAROS OCT-lösningen innan du fortsätter med kryosektionering (16-20 μm) med en kryostat.
       OBS: För åldrande-associerad beta-galaktosidas måste alla vävnader bearbetas för sektionering när de har sjunkit. För immunofluorescens kan vävnader bearbetas för sektionering nästa dag. Alla objektsglas som innehåller sektioner skall förvaras vid -20 °C före efterföljande immunofluorescens eller betagalaktosidas, om de inte färgas omedelbart.
2. Process för analys av åldrande i de kortikala hjärnorganoiderna:
   OBS: Följande steg kan utföras på en vanlig labbbänk.
   1. Överför objektglasen till en färgbehållare för mikroskopglas med lock och tvätta den sektionerade organoidvävnaden tre gånger med 1x PBS i 10 minuter vid RT för att ta bort överflödig monteringslösning.
   2. Inkubera därefter den tvättade vävnaden med nytillverkad beta-galaktosidasfärgningslösning över natten vid 37 °C.
      OBS: Beta-galaktosidasfärgningslösningen är gjord av fosfatbuffert (för 10 ml fosfatbuffert: 8,15 ml 1 M NaH₂PO₄, 1,85 ml 1M Na₂HPO₄) justerat pH = 6, 100 mM kaliumhexacyanoferrat (III), 100 mM kaliumhexacyanoferrat (II) trihydrat, 5 M NaCl, 1 M_MgCl2, 20 mg/ml X-Gal. Undvik att använda en vanlig cellodlingsinkubator innehållande_CO2 eftersom_CO2 kommer att ändra pH i beta-galaktosidasfärgningslösningen.
   3. Tvätta de färgade vävnaderna med 1x PBS tre gånger i 10 minuter vardera vid RT för att avlägsna beta-galaktosidaslösningen.
   4. Montera de tvättade vävnaderna med ett glas antifade-monteringsmedel och låt monteringslösningen stelna i 30 minuter vid RT innan den visas under mikroskopet.

Här har vi beskrivit ett robust protokoll som gör det möjligt för forskare att generera homogena hPSC-härledda kortikala hjärnorganoider som efterliknar den in vivo mänskliga kortikala hjärnregionen inom 1-3 månaders kultur. hPSC-kolonier odlas först i differentieringsmedier för att generera neuroektodermala kolonier, som sedan kan användas för att bilda neurala sfäroider. Dessa sfäroider är därefter inbäddade i en källarmembranmatris och underhålls under längre perioder för att producera organoider som kan användas för att modellera neuronal åldrande (se figur 1 för en översikt över protokollet). Det är värt att notera att odling av dessa organoider i ultrabelagda 24-brunnsplattor orsakar cellulär stress och främjar åldrande-associerade fenotyper under 13 veckors in vitro-kultur . Organoider härledda från detta protokoll kan också bibehållas i omrörda bioreaktorer för optimal tillväxt och differentiering av kortikala plattneuralceller eller vid luft-vätskegränssnittet.

Till att börja med odlas hPSC-kolonier i 1 dag före neuroektodermal differentiering. Det är viktigt att dessa hPSC-kolonier odlas till endast 20%-30% sammanflöde och är av högsta möjliga kvalitet: ett tätt platt monolager utan differentierade celler som förorenar kolonierna (Figur 2A,B). Pluripotensen hos hPSC-kolonierna bör bekräftas genom uttryck av markörer som NANOG (figur 2C). De validerade hPSC-kolonierna exponeras sedan för N2-neuroektodermala differentieringsmedier med SB-431542 och LDN-193189. Efter 3 dagars underhåll i detta media bör hPSC-kolonierna ha differentierats till neuroektodermala kolonier och inte längre visa samma täta platta monolagermorfologi hos hPSC: erna (figur 2B), utan snarare kommer de att bli längre kolumnformade celler (figur 2B). Dessa celler kommer också att vara negativa för pluripotensmarkörer som NANOG (figur 2C).

Det är i detta skede som de neuroektodermala kolonierna är enzymatiskt fristående med dispas, och varje frisk och framgångsrikt fristående koloni får självorganisera och bilda en ung neural sfäroid (Figur 2D, Kompletterande video 1). Endast friska, rena neuroektodermala kolonier kommer att lossna inom den tidsram som anges för dispasaktivitet; alla andra kolonier bör ignoreras eftersom de kommer att resultera i en sämre kvalitet på sfäroid. Med daglig exponering för FGF2 i N2-media kommer de neurala stamcellerna (SOX2+) i dessa sfäroider (figur 2D, dag 1) att sprida sig och bilda ett betydande antal neurala rosetter (figur 2D, dag 4). Dessa rosetter kommer att uttrycka den täta korsningen och epitelmarkören ZO1 i celler som ligger i mitten av rosetterna och längs sfäroidens ytterkant, vilket visar sfäroidens apikal-basala polaritet (figur 2D, dag 4). Metoden för helmonterad 3D-avbildning av sfäroider har beskrivits före¹³. Daglig inspektion av sfäroiderna bör belysa bildandet av en tät, mörk ytterkant och ljus periferi av sfäroiderna, detta är det neuroepiteliella skiktet. Detta skikt bör bildas tillräckligt efter 3-4 dagar med en ungefärlig diameter på 500 μm, vid vilken tidpunkt sfäroiderna kan inbäddas i källarmatrisen. Om detta skikt inte är närvarande eller bara är svagt format, är sfäroiderna inte tillräckligt utvecklade för att gå vidare. Det rekommenderas att vänta en annan dag för att observera någon förändring, men om detta inte observeras, bortse från dessa sfäroider.

En representativ ljusfältbild av sfäroiderna efter 3 dagars kultur kan ses i figur 2D. Sfäroider med ett tätt neuroepitelskikt som inte har smält samman med andra närliggande sfäroider, har halvtransparent vävnad och visar neural rosettbildning, väljs för att vara inbäddade i källarmatrisen. När den är inbäddad kommer sfäroiden att sprida sig snabbt och börja spira: noder av kompakt vävnad kommer att dyka upp och expandera utåt från sfäroidens huvudkropp. Detta är uppenbart mellan 1-3 veckor i källarmatrisen och kan observeras över flera cellinjer (figur 3A). Kvantitativ analys av de inbäddade sfäroiderna bekräftar närvaron av epitelceller i upp till 100% av sfäroiderna över tre olika cellinjer, vilket bekräftar homogeniteten och reproducerbarheten som förväntas av detta protokoll (Figur 3B). Kvantifieringen av organoiders diameter under in vitro-differentiering bekräftar ytterligare reproducerbarheten över olika linjer av hPSC (figur 3C). Om spirande inte uppstår utvecklas inte sfäroiderna på lämpligt sätt och bör kasseras. När sfäroiderna har bäddats in i en matris fortskrider deras utveckling, och sfäroiderna kallas nu organoider. Immunofluorescensfärgning bekräftar också närvaron av neurala stamceller (PAX6) samt kortikala skiktmarkörer färgade med CTIP2 och SATB2 i organoiderna med tydlig skiktning (figur 3D, E). Denna skiktning är observerbar över olika tidpunkter för organoidunderhåll (figur 3D, E). Metoden för immunohistokemi av vävnader har beskrivits före¹⁴.

En möjlig tillämpning av dessa organoider är att studera hur neuronala åldrande-relaterade processer påverkar hjärnan. För att undersöka detta skördas framgångsrikt genererade organoider från flera olika tidpunkter för sektionering och färgning för standardmolekylära biomarkörer för åldrande såsom åldrande-associerad beta-galaktosidas och p21. Figur 4A visar en representativ bild av åldrande associerad beta-galaktosidasfärgning av organoider 4 och 13 veckor efter inbäddning i källarmembranmatrisen. Mellan vecka 4 och 13 finns det en markant ökning av närvaron av åldrande-associerad beta-galaktosidas, vilket tyder på att cellulär åldrande, en erkänd drivkraft för organismens åldrande, har inträffat under denna tid i kulturen. Immunofluorescensfärgning av organoider vid vecka 13 bekräftade närvaron av en annan åldrande markör, p21, sammärkt med den mogna kortikala neuronala markören (CTIP2) och kan ses i figur 4B. Det bör dock noteras att närvaron av p21 är en markör för cellcykelstopp och i sig inte är en definitiv markör för åldrande, och detektion av andra markörer för åldrande såsom p16 och SASP -faktorer (åldrande associerad sekretorisk fenotyp) rekommenderas för att definitivt identifiera celler som åldrande.

Figur 1: Schematiskt diagram för att generera reproducerbara kortikala hjärnorganoider. Schematiskt arbetsflöde för det experimentella förfarandet för generering av kortikala hjärnorganoider från hPSCs som upprätthålls i det matarfria mediet. Arbetsflödet ger en översikt över sex involverade steg för att differentiera 2D hPSC: erna i 3D-mönstrade kortikala platta mänskliga vävnader i organoider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Generering av neurala sfäroider härledda från neuroektodermala kolonier-hPSCs. (A) Representativa bilder av human PSC som uppvisar optimal (vit fästing) och differentierade kolonier (vitt kors). Skalstång: 200 μm, 4x förstoring. (B) Representativ bild av neuroektodermal koloni härledd från hPSCs efter 3 dagars behandlingar med dubbla SMAD-hämmare. Skalstång: 200 μm, 4x förstoring. (C) Mänskliga PSC-kolonier differentierades mot neuroektodermala kolonier. Bilder representerar färgning av PSC (vid dag 1) och neuroektodermala (vid dag 3) kolonier med SOX2 (röd), NANOG (grön), alla kärnor motverkades med Hoechst 33342 (blå). Skalstång: 40 μm, 100x förstoring. (D) Bilder som visar utvecklingsstadierna för kortikala hjärnsfäroider över tid i odling in vitro under brightfield, och fullmount immunostained med SOX2 (Red) vid dag 1 och dubbelimmunstained med SOX2 (röd) och ZO1 (Grön) vid dag 4. Skalstrecket för ljusfältsbilden är 500 μm, 4x förstoring, skalstrecken på de nedre bilderna är 40 μm, 20x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Karakterisering av kortikala hjärnorganoider härledda från olika hPSC-linjer. Skalstrecket för alla bilder är 500 μm, 2x förstoring. (B) Procentandelar av den framgångsrika generationen av kortikala hjärnorganoider vid 3 veckors in vitro-differentiering i olika hPSC-linjer (G22, WTC och EU79). N = 3. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. (C) Stapeldiagram som visar tillväxten av kortikala hjärnorganoider (baserat på medeldiameter) vid vecka 1 och 3 av in vitro-differentiering i olika linjer av humana pluripotenta stamcellslinjer (G22, WTC och EU79). N = 3. Data presenteras som medelvärde ± standardavvikelse. (D) Representativa bilder av sektioner av 6 veckor och 9 veckor gamla kortikala hjärnorganoider härledda från G22 hPSCs, immunostained för ventrikelzon PAX6 (röd) och kortikalplatta CTIP2 (grön). Alla sektioner kontrades med Hoechst 33342 (blå). Skalstreck = 140 μm, 20x förstoring. W är vecka. (E) Representativa bilder av sektioner av 10 veckor och 13 veckor gamla kortikala hjärnorganoider härledda från WTC hPSCs, immunostained för kortikalt lager IV SATB2 (grönt). Alla sektioner kontrades med Hoechst 33342 (blå). 10 veckors bild Skalstreck = 50 μm, 40x förstoring. 13 veckors bild Skalstreck = 150 μm, 40x förstoring. W är vecka. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Karakterisering av åldrande i kortikala hjärnorganoider härledda från hPSCs. (A) Representativa bilder av sektioner av humana kortikala hjärnorganoider härledda från WTC hPSCs odlade i 4 och 13 veckor in vitro och färgade med SA-β-gal. Skalstreck = 500 μm, skalstreck för zoomade bilder = 250 μm, 4x förstoring. Den prickade rutan indikerar en förstorad bild. (B) Representativa bilder av sektioner av 13 veckor gamla kortikala hjärnorganoider som härrör från humana EU79 hPSC, immunstifierade för kortikala nervceller CTIP2 (grön) och p21 (röd). Alla sektionerna kontrades med Hoechst 33342 (blå). Skalstreck = 25 μm, skalstreck för zoomade bilder = 10 μm, 40x förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: N2 Medium. Tabellen visar de reagenser som krävs för att bereda N2-mediet.

Tabell 2: Differentieringsmedium (DM). Tabellen visar de reagenser som krävs för att förbereda differentieringsmediet.

Kompletterande video 1. Levande avbildning av inducerad hNEct 2D-ark / koloniomvandling till 3D under behandling av bFGF. Inducerade kolonier av hNEct lossnade försiktigt från skålen med dispas som beskrivs ovan och överfördes till en låg bindnings 6-brunns odlingsplatta. 2D hNEct-kolonier omvandlades till 3D hNEct-sfäroider inom 12 timmar. Seriebilder togs var 5:e minut. Skalfält = 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.

För att möjliggöra användning av hPSC-härledda hjärnorganoider vid läkemedelsscreening och sjukdomsmodellering är det avgörande att göra organoider efter ett replikerbart och tillförlitligt protokoll¹⁵. Hjärnorganoider genereras vanligtvis från embryoidkroppar härledda från hPSCs, som sedan är inbäddade i en extracellulär matris som främjar vävnadsutvidgning och neural differentiering. Jämfört med sådana protokoll som Lancasters ^1,16,17 och Velasco¹⁸, som börjar från embryoidkroppar och möjliggör en standarddifferentieringsväg som kan följas av de utvecklande organoiderna, har vi funnit att påbörjande kortikal hjärnorganoidbildning med humana NEct-celler snarare än med embryoidkroppar förbättrar konsistensen av kortikal hjärnorganoidbildning. Detta möjliggör följaktligen också den skalning som krävs för läkemedels- och fenotypisk screening. Eftersom humana NEct-celler inte bara kan expanderas till betydande mängder utan också lätt kan kryokonserveras, förbättrar detta tillvägagångssätt också replikerbarheten mellan experiment. Det bör också noteras att jämfört med andra protokoll som har antagit användningen av bioreaktorer och liknande tekniker krävs ingen specialutrustning för detta protokoll, vilket gör den lämplig för alla^{laboratorier 6}. Slutligen reduceras den tid som krävs för att generera mogna organoider som är positiva för kortikala skiktmarkörer som SATB2 jämfört med både Lancaster¹ och bioreaktorprotokoll ^6,19 vilket gör det mer lämpligt för att studera utvecklingsbanan för mänsklig kortikal utveckling inom hälsa och sjukdomar ^1,6,16.

Dessutom, med tanke på den ständigt växande globala hälso- och sjukvårdseffekten av åldranderelaterade sjukdomar som demens, som är förknippade med en ökning av åldrande celltyper i hjärnan som bidrar till patogenes, är förmågan att identifiera och testa föreningar som kan förbättra hjärnans åldrande av enormt intresse. Trots att hPSCs är kända för att vara epigenetiskt föryngrade under omprogrammeringsprocessen²⁰, finner vi robusta ökningar av åldrande celler i kortikala hjärnorganoider odlade under längre perioder. Detta är en lovande utveckling som nu möjliggör screening av läkemedel som eliminerar sådana åldrande celler från hjärnan (senolytika) eller som saktar ner denna process (senostatika)²¹. Eftersom humana NEct-härledda kortikala hjärnorganoider är av mänskligt ursprung, kommer detta tillvägagångssätt sannolikt att förkorta den traditionella vägen till marknaden för sådana nya terapier.

Det finns två kritiska steg i detta protokoll. Den första är den korrekta sammanflödesnivån för hPSC-kolonierna vid tidpunkten för differentieringen. hPSC-kolonier måste vara högst 30% konfluenta för att säkerställa att genererade NEct-kolonier inte smälter samman med angränsande kolonier och att enskilda organoider drivs klonalt. Det andra kritiska steget innebär korrekt användning av dispas för att lyfta NEct-kolonierna och producera neurala sfäroider. Tidpunkten för inkubation med dispas är avgörande för den slutliga kvaliteten på de neurala sfäroider som genereras. Detta beror på att överexponering av kolonier med dispas är giftigt för cellerna²² och så småningom påverkar kvaliteten på genererade organoider. Begränsningen av detta protokoll är att det är svårt att kontrollera storleken på de neurala sfäroiderna eftersom det är beroende av storleken på de ursprungliga kolonierna som lyfts med dispas. Detta problem kan dock övervinnas genom att välja neurala sfäroider som är av samma storlek när de går vidare till inbäddningssteget.

Slutligen kan framtida tillämpningar utvidgas till att omfatta användningen av dessa reproducerbara kortikala organoider i robotanalys och biofarmaceutiska screeningmetoder som vanligtvis används i den industrin. Detta stöds av preliminära data från vårt laboratorium som indikerar att genereringen av kortikala hjärnorganoider från mänskliga NEct-celler lätt kan automatiseras, vilket gör den kompatibel med dessa metoder.

Författarna har inget att avslöja.

Detta arbete stöds av Medical Research Future Fund-Accelerated Research, Leukodystrofi flaggskepp Massimo's Mission (EPCD000034), Medical Research Future Fund-Stem Cell Mission (APP2007653). Författare vill tacka Dr. Ju-Hyun Lee (Korea University) för att ha genererat data i kompletterande video 1.