קביעת יעילות חיטוי ויראלי של הלבנת מים חמים

Summary

בתגובה למגפת התסמונת הנשימתית החריפה החמורה נגיף הקורונה 2 (SARS-CoV-2), פותח פרוטוקול מעבדה לבדיקת יעילות החיטוי הנגיפי של הלבנת מים חמים של כיסויי פנים מבד, קרצוף כותנה ומכנסי ג'ינס. נגיף Phi6 (בקטריופאג') שימש כאורגניזם לבדיקת יעילות החיטוי.

Abstract

פרוטוקול זה מספק דוגמה לתהליך מעבדה לביצוע מחקרי הלבנה המפיקים נתונים על חיטוי ויראלי. בעוד שהפרוטוקול פותח למחקר במהלך מגפת הקורונה 2019 (COVID-19), הוא נועד להיות מסגרת, הניתנת להתאמה למחקרי חיטוי וירוסים אחרים; הוא מדגים את השלבים להכנת נגיף הבדיקה, חיסון חומר הבדיקה, הערכת שינויים חזותיים ותקינות בפריטים שנשטפו עקב תהליך הכביסה, וכימות הירידה בעומס הנגיפי. בנוסף, הפרוטוקול מתווה את דגימות בקרת האיכות הדרושות כדי להבטיח שהניסויים אינם מוטים על ידי זיהום ומדידות / תצפיות שיש לרשום כדי לעקוב אחר שלמות החומר של פריטי ציוד המגן האישי (PPE) לאחר מחזורי כביסה מרובים. התוצאות המייצגות שהוצגו עם הפרוטוקול משתמשות בבקטריופאג' Phi6 שחוסן על גבי חומרי קרצוף כותנה, ג'ינס וכותנה לכיסוי פנים ומצביעות על כך שתהליך הכביסה והייבוש במים חמים שהושג על ידי הפחתה של 3 לוגים (99.9%) בעומס הנגיפי עבור כל הדגימות (הפחתה של 3 לוגים היא מדד ביצועי החיטוי בהנחיית בדיקת ביצועי המוצר של הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב 810.2200). הירידה בעומס הנגיפי הייתה אחידה במקומות שונים על פריטי ה-PPE. התוצאות של פרוטוקול בדיקת יעילות החיטוי הנגיפי הזה אמורות לסייע לקהילה המדעית לחקור את היעילות של הלבנה ביתית עבור סוגים אחרים של נגיפי בדיקה ונהלי כביסה.

Introduction

מגפת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19) גרמה לשיבושים חסרי תקדים בשרשרת האספקה העולמית והובילה למחסור קריטי בפריטים רבים, כולל ציוד מגן אישי חיוני ⁽PPE)^1,2,3. אלה במקצועות בסיכון גבוה נאלצו להסתגל באמצעות אסטרטגיות קיבולת משבר מומלצות והציבור אימץ את השימוש בפריטים שאינם מיוחדים כגון כיסויי פנים מחומרי בד בעיקר לבקרת מקור, אך גם כדי לספק הגנה נשימתית מסוימת ללובשים. בארצות הברית, הגנה נשימתית מיוחדת (כלומר, סינון מכונות הנשמה (FFRs) כגון N95s) הייתה שמורה לחלק מהעיסוקים בסיכון גבוה אלה (למשל, שירותי בריאות) במהלך מחסור באספקה⁴. כאשר מעט מאוד היה ידוע על העברת נגיף קורונה 2 (SARS-Cov-2) עם תסמונת נשימתית חריפה חמורה, מגוון סוגים אחרים של חומרי לבוש נחשבו גם הם כהגנה על מחסום בתחילת המגיפה⁵. עם מגוון הבדים המשמשים להגנה על הלובשים, עלו שאלות לגבי השימוש, השימוש החוזר והחיטוי/טיהור של פריטים אלה. בעוד שבארצות הברית היה מקובל כי כביסה שגרתית במכונות ביתיות של כיסויי פנים ופריטי לבוש אחרים הפכה וירוסים על משטחים אלה ללא זיהומיים, נתונים מעטים היו קיימים כדי לאמת טענה זו, והיה מחסור בפרוטוקולי מעבדה שפורסמו לבדיקה. מטרת פרוטוקול המחקר המוצג כאן היא לספק דוגמה לתהליך מעבדתי לביצוע מחקרי הלבנה המפיקים נתונים על חיטוי ויראלי. בעוד שהפרוטוקול פותח למחקר במהלך מגיפת COVID-19, הוא נועד להיות מסגרת הניתנת להתאמה למחקרי חיטוי וירוסים אחרים.

תפקיד הבגדים בהעברת מחלות הוא מושג קשה לכימות. הפורום המדעי הבינלאומי להיגיינה ביתית ניסה משימה מאתגרת זו על ידי עריכת סקירה של תפקיד הבגדים בהתפשטות מחלות זיהומיות יחד עם הערכת סיכונים של נוהלי היגיינה ביתית⁶. בעבודה זו נכללה סקירה של מספר מחקרים מדעיים שבחנו את הישרדותם של זנים נגיפיים שונים על סוגים שונים של בדים כגון צמר וכותנה ^7,8,9,10,11. כל מחקר התמקד בסוג אחר של נגיף, כולל vaccinia, poliovirus, וירוס סינסיטיאלי נשימתי, וירוס הרפס ונגיף שפעת. זמני ההישרדות של הנגיפים השונים על הבדים נעו בין 30 דקות ל-5 חודשים, תלוי בשילוב הנגיף-חומר. כמה מהמחקרים גם הדגימו העברת זיהום ויראלי מהחומר אל הידיים. במסגרת הפרסום נדונה הלבנה יעילה כטכניקת ניהול חשובה לצמצום ההדבקה, אך הכירה בכך שעוצמת ההשפעה של הכביסה על הפחתת נטל התחלואה תלויה במזהם הנגיפי הספציפי וקשה לכמת^{אותה 7,8,9,10,11}.

תהליך הכביסה הורס מיקרואורגניזמים באמצעות תהליכי טיפול כימיים, פיזיקליים ותרמיים. לדוגמה, סבונים ודטרגנטים יכולים להפריד קרקעות ועשויים להקנות פעילות אנטי-מיקרוביאלית בתיווך כימי. מבחינה פיזית, דילול ותסיסה עשויים לסייע בהפחתת העומס הנגיפי. מחקר שבחן את ההתמדה של נגיף הקורונה האנושי HCoV-OC43 על דוגמיות כותנה באמצעות מחזורי כביסה תעשייתיים וביתיים עם ובלי טמפרטורה וחומר ניקוי לא מצא שום וירוס הניתן לזיהוי בעת שטיפה במים לא מחוממים ללא חומר ניקוי, אלא שבנוכחות עומס קרקע (רוק מלאכותי), מחזורי שטיפה ביתיים דרשו חומר ניקוי כדי שלדגימות יהיו עומסי וירוסים שאינם מזוהים¹². מים חמים עצמם יכולים גם לספק אמצעי יעיל להשמדת מיקרואורגניזמים מסוימים^13,14.

בפרסום שפורסם לאחרונה המסכם את מצב שיטות הכביסה הנוכחיות, גורמים רבים כגון הרכב הבד, תנאי האחסון, עומס הלכלוך, טמפרטורת הכביסה וזמן הייבוש וטמפרטורת הייבוש זוהו כמשתנים בפרקטיקות הגלובליות של כביסה¹⁵. בעוד שכביסה היא שיטת ניקוי נפוצה עבור אחוז גדול מהאוכלוסייה, השונות הגדולה הזו בפרקטיקות הקיימות הופכת את הוצאת ההנחיות המפורטות כיצד לעשות זאת בצורה בטוחה ויעילה, כאשר פריט עלול להיות מזוהם על ידי וירוס, למאתגרת ודלילה. במהלך מגפת COVID-19, המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן בארצות הברית (CDC) פרסמו הנחיות כיצד להלבין פריטים עבור בעלי בתים^16,17. חלק גדול מהנחיית הכביסה הזו התבסס על כמה מחקרים ישנים יותר על חיטוי חיידקים^18,19 ונתמך על ידי מספר מחקרים על ספסל שמצאו וירוסים עטופים מומתים במים עם דטרגנטים^20,21. ניתן לסכם את ההנחיות כ- 1) עקוב אחר הוראות היצרן עבור חומר הניקוי, 2) השתמש בהגדרת המים המתאימה החמה ביותר, ו- 3) ייבש פריטים לחלוטין. הרציונל של המלצות אלה היה ששטיפה במחזור החם ביותר האפשרי עם חומר ניקוי בשילוב עם ייבוש מוחלט (עם חום אם אפשר) תהרוג את נגיף SARS-CoV-2.

המספר העצום של וריאציות אפשריות בתהליך הכביסה מחייב פרוטוקול אחיד, כמו זה שהוצג כאן, כדי להיות מסוגל לבודד משתנים ולבדוק את יעילות החיטוי הנגיפי של תהליכים ספציפיים. הכוונה של פרוטוקול זה יחד עם סרטון הדרכה היא להדגים תהליך הלבנת מים חמים במעבדה לשכפול במחקרים אחרים. בנוסף, התוצאות של בדיקת היעילות של חיטוי ויראלי זה צריכות לבנות את אמון הצרכנים ביעילות של הלבנת בתים במהלך מגיפות מבוססות נגיפיות.

Protocol

Phi6 התקבל ממעבדת שיתוף פעולה כאליקוט קפוא של ~ 1 מ"ל ואוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. הוא שימש בתחילה להפצת מלאי וירוסים נוספים אשר אוחסנו לאחר מכן ב -80 מעלות צלזיוס עד השימוש. Phi6 נבחר כנגיף ההדגמה מכיוון שהוא משמש בדרך כלל כנגיף מעטפת מודל, ניתן להפיץ אותו לטיטרים גבוהים, ודורש מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית נמוכה כדי לבצע את הבדיקה^22,23,24.

1. הכן פתרון מלאי וירוסים

1. להפיץ בקטריופאג' Phi6 במזרק פסאודומונס מארח חיידקי באמצעות הכנת מדיה טריפטית שונה של Soy Agar ושיטת כיסוי אגר רכה כמתואר להלן.
   1. הכינו אגר סויה טריפטי מעובד על ידי שקילה וערבוב המרכיבים מטבלה 1 במים שעברו דה-יוניזציה.
   2. הכינו תרבית לילה של מזרק P. על ידי הוספת אליקוט של 1 מ"ל של מזרק P. עם צפיפות אופטית (OD₆₀₀) בין 0.9 ל-1.5, ל-100 מ"ל של מרק סויה טריפטי שונה (טבלה 1) ודגירה באינקובטור רועד ב~260 סל"ד בטמפרטורת החדר (20-26 מעלות צלזיוס).
   3. הכינו צינורות אגר רכים על ידי הנחת אגר סויה טריפטי שונה (~ 6 מ"ל) במבחנות וכיסוי בכובע אוטומטי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש. אוטוקלאב צינורות אגר רכים בטמפרטורה של 121°C למשך 15 דקות להמסת אגר. יש להחזיק בטמפרטורה של 48°C עד לציפוי. שיווי משקל ב-48 מעלות צלזיוס הוא חשוב, אחרת הנגיף עלול להיות מומת בבדיקה.
   4. הוסף 1 מ"ל של אליקוט וירוס מרוכז לא מדולל לאגר רך ו-100 μL של שלב לוג (OD₆₀₀ בין 0.9 ל-1.5) תרבית מזרק P. יוצקים אגר רך על פני השטח של צלחת אגר סויה טריפטית מוצקה בקוטר 100 מ"מ. כדי למנוע בועות ו/או שפיכה, יש לסובב את הלוחות בעדינות כדי לפזר את האגר הרך באופן שווה על פני משטח האגר המוצק ולדגור במשך הלילה בטמפרטורת החדר.
   5. מגרדים בעדינות²⁵ מתכולת שלושת הלוחות בעזרת מפזר תאים סטרילי לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל המכיל 15 מ"ל של חיץ SM. צינורות מערבולת בהגדרה מקסימלית למשך 1-2 דקות כדי לפרק אגר ולאחר מכן צנטריפוגה ב 7,000 x גרם במשך 15 דקות.
   6. הסר סופרנטנט וסנן דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. יש לאחסן 1 מ"ל בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

2. בצע הערכה חזותית לפני הבדיקה של פריט PPE

1. הניחו כל פריט PPE על משטח נקי וחלק (למשל, ספסל מעבדה המכוסה בתוחם נייר חד פעמי). הערך כל פריט PPE במשולש.
2. הקפידו על תאורה נאותה במהלך בדיקת ה-PPE. מדדו ותעדו את האורך והרוחב של הפריטים הלא שטופים במקומות שונים (איור 1).

איור 1. מיקומי מדידה של הערכת PPE לפני הבדיקה. מקומות ג'ינס, קרצוף וכיסוי פנים שבהם נרשם האורך לצורך מעקב אחר שינויים מהותיים מתהליך הכביסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. הכינו קופונים

1. הכינו תלושי בדיקה בגודל 2 ס"מ על 4 ס"מ על ידי חיתוך PPE, הכינו שני קופונים לכל כיסוי פנים (נבדקו שלושה כיסויי פנים), חמישה קופונים למכנס ג'ינס (נבדקו שלושה מכנסי ג'ינס) ושלושה קופונים לכל חולצת קרצוף (נבדקו שלושה קרצוף).
2. הכינו סט של קופונים ריקים פרוצדורליים בגודל 2 ס"מ על 4 ס"מ (סט לפריט PPE אחד בגודל מלא) לכל סוג חומר שלא יתחסן אך יכובס. הכינו שני קופונים לכל יום של ניסויים בכיסוי פנים, חמישה קופונים לכל יום של ניסויי ג'ינס, ושלושה קופונים לכל יום של ניסויי קרצוף.
3. הכינו סט של קופוני בקרה חיובית בגודל 2 ס"מ על 4 ס"מ שיחוסנו, אך לא יכובסו. הכינו שני קופונים לכל יום של ניסויים בכיסוי פנים (שלושה כיסויי פנים נבדקו), חמישה קופונים לכל יום של ניסויי ג'ינס (שלושה מכנסי ג'ינס נבדקו), ושלושה קופונים לכל יום של ניסויי קרצוף (שלושה סקראבים נבדקו), ושלושה קופונים מפלדת אל-חלד.
   הערה: מספר שונה של עותקים משוכפלים נבחרו בהתאם לגודל הפריט. לדוגמה, קשה פיזית להדביק חמישה קופונים על כיסוי הפנים, ושני קופונים ייצגו שטח מוגבל של מכנסי הג'ינס. המיקומים נבחרו כדי למקסם את הכיסוי ובאזורים שעלולים להתקפל במהלך הכביסה ולהיות קשים יותר לניקוי.

4. בצע חיסון

1. הכינו תמיסת תמצית בקר 10% על ידי המסת 1 גרם של תמצית בקר בנפח כולל של 10 מ"ל של מי מלח 1x פוספט חצוי. המסנן מעקר את כל אמצעי האחסון באמצעות מסנן מזרק בגודל 0.2 מיקרומטר.
2. להפשיר את תמיסת מלאי הנגיף שהוכנה בסעיף 1 בטמפרטורת החדר. ביום השימוש, יש להוסיף 100 μL של ציר Phi6 המופשר ל-900 μL של תמיסת תמצית בקר 10%.
3. חיסון קופוני בדיקה וקופונים לבקרה חיובית עם ~ 10⁷ PFU / דגימה על ידי צינורית טיפת תמיסה של 10 μL על פריט PPE והפצת הטיפות באמצעות קצה הפיפטה. בהתאם לחומר ה-PPE, הטיפות ייפרדו ויצטברו מחדש באופן שונה.
4. אפשרו לקופונים מחוסנים להתייבש בארון בטיחות ביולוגית. קבעו את זמני הייבוש באמצעות תצפית על החומרים הספציפיים שלכם. עבור התוצאות המוצגות כאן, נעשה שימוש בזמנים הבאים: קרצוף = 30 דקות זמן יבש; כיסוי פנים = 60 דקות זמן יבש; ג'ינס = 30 דקות זמן ייבוש; נירוסטה = 120 דקות זמן ייבוש.
5. הצמידו קופונים מחוסנים לפריטי PPE בגודל מלא לפי איור 2 באמצעות סיכות בטיחות וטכניקות אספטיות.

איור 2. בדקו את מיקומי הקופונים על ג'ינס, קרצוף וכיסויי פנים. האותיות A-D תואמות את מזהי הקופון הייחודיים לכל ניסויי הכביסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

5. בצע כביסה

1. הכינו את חומר הניקוי לכביסה באופן הבא.
   1. יש לעקר מי ברז שישמשו במכונת הכביסה ולאסוף 10 מ"ל מים אוטומטיים לבדיקת סטריליות. עבור פרוטוקול זה, autoclave 7 ליטר של מי ברז על מחזור נוזל של 60 דקות.
   2. הכינו תמיסת כביסה בהתאם להוראות הדילול של היצרן. עבור פרוטוקול זה, יש להמיס 1.54 מ"ל של חומר ניקוי ב-3.5 ליטר של מי ברז סטריליים. חממו את תמיסת הכביסה ל-50°C באמצעות פלטה חמה וערבבו. מדוד ורשום את ה- pH והטמפרטורה של תמיסת הכביסה. לאסוף 10 מ"ל של פתרון עבור בדיקת סטריליות.
2. יוצקים תמיסת כביסה לתוך מכונת כביסה מעוקרת (3.25 L). יש לעקר מראש מכונות כביסה באמצעות מחזור של 250 ppm-4 שעות של מי חמצן אדים בין הבדיקות.
3. הנח פריטי PPE במכונת כביסה מעוקרת. הוסיפו מכנסי ג'ינס אחד וחולצת קרצוף אחת לכל מכונת כביסה. הוסף כיסוי פנים מחוסן אחד וארבע מסכות מילוי לא מזוהמות לכל מכונת כביסה; למסכות מילוי לא היו מחוברים קופונים.
4. יש לשטוף פריט PPE למשך 18 דקות (שני מחזורי כביסה של 9 דקות עם תסיסה רגילה). מסננים את מכונת הכביסה ושוטפים שלוש עם מי ברז בטמפרטורת החדר (5 ליטר בכל פעם) להסרת קצף. הוסיפו מי ברז מעוקרים בטמפרטורת החדר למכונת הכביסה (3.25 ליטר) ובצעו מחזור שטיפה באורך 9 דקות.
5. הזז את פריטי ה- PPE לצד הסיבוב של מכונת הכביסה וסובב במשך 5 דקות. העבירו את פריטי ה-PPE למייבש וייבשו במשך 80 דקות על הגדרת החום הגבוה (93°C).
6. העבר PPE ממייבש לסביבת עבודה סטרילית והסר באופן אספטי את הקופונים מכל פריט והנח אותם בצינורות חרוטיים. ממלאים מראש את הצינורות ב-10 מ"ל של 10% חיץ מיצוי מרק Dey-Engley ומכסים ברדיד אלומיניום.

6. לחלץ ולמנות מטענים ויראליים על קופונים

1. חלץ קופונים ב-10 מ"ל של מרק מנטרל Dey-Engley 10% על ידי מערבולת למשך 2 דקות בהגדרה המרבית של הציוד שלך.
2. תמציות צלחת בשיטת כיסוי אגר עליונה רכה קונבנציונלית²⁶.
   1. הכן צינורות של אגר סויה טריפטי רך שונה ותרבית מזרק P . כמתואר בסעיף 1. ביום הבדיקה, autoclave את צינורות אגר רך ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להמיס את agar. החזיקו את האגר הרך בטמפרטורה של 48°C עד לציפוי. שיווי משקל ב-48 מעלות צלזיוס הוא חשוב, אחרת הנגיף יכול להיות מומת תרמית בבדיקה.
   2. הכינו סדרת דילול של פי עשרה במי מלח עם אגירת פוספטים עבור כל דגימת בדיקה ששימשה במחקר הכביסה. יש להשתמש הן באליקוטים מדוללים סדרתיים (100 μL) והן לא מדוללים (1 מ"ל ו-100 μL) לציפוי.
   3. הוסף אליקוטים לדוגמה לצינור האגר הרך המכיל 6 מ"ל של אגר רך ו-100 μL של תרבית מזרק P . שלב הלוג (OD₆₀₀ בין 0.9-1.5). יוצקים את האגר הרך על פני השטח של צלחת אגר סויה טריפטית ממוצקת. פזרו את האגר הרך באופן שווה על פני משטח האגר המוצק על ידי סיבוב הצלחת.
   4. דגרו לוחות למשך הלילה בטמפרטורת החדר וספרו ידנית את היום שלמחרת על ידי ספירת היחידות יוצרות הרובד על כל צלחת.

7. בצע הערכה חזותית לאחר הבדיקה של פריטי PPE

1. תעד את הדברים הבאים בפריטי PPE השונים המשמשים לבדיקה: סימני דהייה, שינוי צבע ו/או נזק (לדוגמה, קריעה, מתיחה); ריחות; חורים קטנים, חתכים או קרעים (השתמש בפנס קטן כדי לחפש נזק); הפרדת שכבות, חוטים חסרים, אזורים שבהם הכריכה פגומה; נזק לתפרים או לרוכסן; למדוד ולהקליט את המתיחה של אלסטי.

תוצאות

מספר סוגים שונים של נתוני בקרת איכות ותוצאות נוצרים לאחר השלמת פרוטוקול זה. ספירת לוחות יצירת רובד (PFU) יחד עם נפח הדגימה שחולץ מאפשרים לחשב את מספר ה- PFU לכל קופון בדיקה. טבלה 2 היא דוגמה לגיליון הקלטת נתונים לקבלת תוצאות דילול/ציפוי סדרתי. באמצעות גורם הדילול, נפח הדגימה וספירת הצלחות מטבלה 1, טבלה 3 מציגה תוצאות התאוששות נגיפיות מייצגות עבור בדיקת כיסוי פנים. שים לב שנתונים אלה כוללים את תלושי הבדיקה ואת דגימות בקרת האיכות עבור האינוקולום, הקופונים ומי הכביסה (עם ובלי חומר ניקוי). דגימות בקרת האיכות הפרוצדורליות והסטריליות חשובות כדי לאשר שתמיסות המים וחומרי ה- PPE לא היו מזוהמים ב- Phi6. אינדיקציה לזיהום תגרום לחישובים שגויים של יעילות החיטוי ותחייב את הבדיקה לחזור על עצמה. דגימות הבקרה החיובית נועדו לוודא שתמיסת מלאי הנגיף לא התדרדרה מבחינה סביבתית/טבעית במהלך הניסויים, ובכך לנפח את השפעת תהליך הכביסה בהפחתת העומס הנגיפי. דגימות אלה צריכות להישאר בתוך 1 יומן PFU של פקדי inoculum כדי לקבל את תוצאות קופון הבדיקה. הפחתה גדולה ב- PFU של דגימות הבקרה החיוביות מצביעה גם על כך שיש לבחון בקפידה את כל השלבים של חיסון הקופון כדי להבטיח שהאנליסט מבצע את הפרוטוקול עם טכניקות צנרת והפצה מתאימות.

פרוטוקול זה מספק גם מידע להערכת שינויים בתכונות החומריות של פריטי לבוש עקב מידע על הלבנה ובקרת איכות הנוגעים לפרוטוקול (טבלה 4 ואיור 3). נתונים אלה שימושיים מכמה סיבות. רישום המגמות במדידות של פריטי PPE מאפשר זיהוי של פריט עם פגם בייצור. זיהוי זה עשוי לעזור להסביר נתונים מיקרוביאליים חריגים ולהקשר את השונות בהתנהגות המוצר. רישום של ריחות או נזקים עשוי גם לספק אינדיקציה אם מכונת הכביסה או המייבש פעלו בצורה לא אופטימלית במהלך ניסוי ואם יש לחזור על הבדיקות או לטפל בציוד. בנוסף, אם תוכנית הבדיקה דורשת מחזורי כביסה מרובים של אותו פריט PPE, הנתונים עשויים לסייע לקבוע כמה זמן פריטי PPE שומרים על שלמותם לשימוש בעת הכביסה. שמירה על רישום ה- pH של תמיסת הדטרגנט מספקת התראה לשינויים במקור המים או במוצר הדטרגנט. ניהול יומן זמן של שלבי הכביסה מבטיח כי הטיימר על מכונת הכביסה והמייבש אינו גורם לשינויים בפרוטוקול הניסוי.

בסופו של דבר, נתונים אלה משמשים לדיווח על יעילות החיטוי של הליך הלבנת המים החמים נגד פונדקאית לפתוגנים ויראליים. יעילות חיטוי הלבנת הכביסה (Eqn. 1) מחושבת על ידי חיסור ממוצע של יומן 10 מחלימים מנגיף מקופון בדיקת PPE מתוך היומן הממוצע₁₀ מחלימים של וירוסים מתוצאות בקרה חיובית של PPE (איור 4). עבור תוצאות קופון בדיקה שאינן מזוהות, היומן₁₀ של מגבלת הגילוי משמש בחישוב יעילות החיטוי. מקובל לדווח על יעילות החיטוי כערכי יומן לצורך השוואה עם טכניקות וסטנדרטים אחרים של חיטוי ויראלי.

יעילות חיטוי = יומן ממוצע 10 (בקרות חיוביות) - יומן ממוצע₁₀ (שוברי בדיקה) (Eqn. 1)

איור 3. שינוי במידות PPE לפי מיקום. Δ = מדידה לפני הבדיקה - מדידה לאחר הבדיקה. ערך Δ שלילי מתאים למתיחה של הפריט במיקום שצוין וערך חיובי מתאים להתכווצות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תרשים 4. יעילות של הלבנת מים חמים בחיטוי כיסויי פנים, ג'ינס וחומרי PPE לשפשוף מבית Phi6. כוכבים מציינים חיטוי מלא שהתרחש (אי זיהוי בתלושי הבדיקה). קווי שגיאה מציינים סטיית תקן (n = 3). אותיות מיקום מתאימות למיקום המתואר באיור 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1. מתכוני פתרון. המרכיבים והכמויות הדרושים להכנת אגר סויה טריפטי, מרק סויה טריפטי ותמיסות תמצית בקר. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 2. חלק לדוגמה של גיליון תוצאות דילול/ציפוי סדרתי. תבנית לדיווח על נתונים מיקרוביאליים גולמיים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 3. תוצאות מיקרוביאליות לכיסוי פנים. גיליון סיכום לדוגמה עבור נתוני יחידה יוצרת רובד מעובד (PFU). אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

טבלה 4. סקראבס בקרת איכות ויומן הערכת חומרים. תבנית לדיווח על כיול של בדיקת pH, pH של תמיסת חומרי ניקוי, מדידות לפני ואחרי הכביסה וזמני מחזור הכביסה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

פרוטוקול זה פותח כדי לבצע בדיקות מעבדה שיטתיות כדי להעריך את יעילות הכביסה של חיטוי ויראלי מפריטי PPE/בגדים בגודל מלא. הנהלים מפרטים את השלבים הקריטיים להכנת הנגיף, לחיסון חומר הבדיקה, להערכת השינויים בפריטים עקב תהליך הכביסה ולכימות הירידה בעומס הנגיפי כתוצאה מתהליך הכביסה (כביסה וייבוש במכונה). בנוסף, הפרוטוקול מתווה את דגימות בקרת האיכות הדרושות כדי להבטיח שהניסויים אינם מוטים על ידי זיהום ומדידות / תצפיות שיש לרשום כדי לעקוב אחר שלמות החומר של פריטי PPE לאחר מחזורי כביסה מרובים. התוצאות באמצעות Phi6 מצביעות על כך שתהליך הלבנת המים החמים המשמש בפרוטוקול זה השיג הפחתה של יותר מ-3 לוגים בעומס הנגיפי עבור כל הדגימות (כיסוי פנים, פילינג ומכנסי ג'ינס). הפחתת העומס הנגיפי הייתה אחידה גם במקומות שונים על פריטי ה-PPE/ביגוד. כדי להדגים הפחתה של 3 לוגים, פרוטוקול זה דורש שימוש בעומס ויראלי גבוה ובחומר מייצב (תמצית בקר) שאולי אינו מייצג את עומס הקרקע לכל המצבים.

מכונות כביסה קטנות ומייבשי כביסה קומפקטיים נבחרו כדי לייעל את מספר הניסויים המשוכפלים שניתן לערוך בסביבה מוגבלת בחלל וכדי לשמור על עיקור הציוד ונפח המים המשמשים במהלך הניסויים לניהול עבור צוות המעבדה. כתוצאה מהשימוש במכונת הכביסה הזעירה, שלבי השטיפה היו ידניים בהשוואה לרוב יישומי הכביסה הביתית שהם אוטומטיים לחלוטין. חשוב גם לזכור כי כביסה במכונה שולטת במדינות מפותחות, אך שטיפת ידיים עדיין נהוגה בכל רחבי העולם¹⁵. בנוסף, ייתכן שלחלקם לא תהיה גישה למים חמים לכביסה, ואחרים ייבשו בגדים באוויר באופן ידני במקום ייבוש במכונה. הבדלים אלה בשיטות הכביסה לא טופלו בפרוטוקול הנוכחי, אך ניתן היה לחקור אותם בקלות באמצעות שינויים קלים כגון החלפת שלבי הכביסה והייבוש בשימוש בדלי ובקו סגור

יש התמקדות מינימלית בניקוי / חיטוי של כיסויי פנים ובגדי רחוב מזוהמים ויראלית בספרות המדעית בקנה מידה מלא. באופן נפוץ יותר, מחקרים מעריכים את ביצועי הסינון של כיסויי פנים לאחר שטיפה וייבוש חוזרים ונשנים, אך אינם מעריכים את יעילות החיטוי הנגיפי^27,28. לדוגמה, Clapp et al. העריכו את יעילות הסינון המותאם של מסכות בד ומסכות פרוצדורה מותאמות ומצאו שונות רבה בביצועים, כאשר שינויים פשוטים מספקים התאמה ויעילות סינון מוגברים²⁹. מחקר אחר בחן את יעילות הסינון של ארבע מסכות בד מחומרים שונים³⁰, ושוב התמקד בבקרת מקור או בהגנה אישית. ייתכן שהדבר נובע מחוסר התמחות הן בחלק המיקרוביאלי והן בבדיקה מכנית באותה מעבדה. הפרוטוקול המוצג כאן מספק הערכה של יעילות החיטוי כמו גם השפלה של חומרים.

קיימות מספר שיטות טיהור/חיטוי להגנה נשימתית חד פעמית (בעיקר N95s) שפורסמו לאחרונה בספרות המדעית^31,32,33. ההתמקדות העיקרית ב-FFRs (למשל, N95s) נובעת מההגנה הנשימתית הקריטית שהם מספקים לעובדי בריאות ולעיסוקים אחרים בקו החזית. הטכנולוגיות העיקריות לפירוק מכונות הנשמה כללו מי חמצן מאודים (VHP), קרינה חיידקית אולטרה סגולה (UVGI) וחום לח (קיטור) להשבתת הנגיף. Viscusi et al. העריכו חמש שיטות טיהור עבור FFRs ו- UVGI; אתילן אוקסיד ו- VHP נמצאו כשיטות הטיהור המבטיחות ביותר³¹. Fischer et al. העריכו ארבע שיטות טיהור שונות - אור UV, חום יבש, 70% אתנול ו-VHP - על יכולתן להפחית את הזיהום עם SARS-CoV-2 והשפעתן על פונקציית ההנשמה N95³². ישנם מחקרים רבים נוספים על טכנולוגיות טיהור יעילות עבור FFRs אשר סוכמו ופורסמו בשנת 2020³³. עם זאת, שיטות מיוחדות אלה אינן נגישות או מתוכננות לשימוש בטוח על ידי בעל הבית הממוצע או העסק הקטן.

פרוטוקול זה פותח באמצעות Phi6, בקטריופאג' עטוף הדומה ל-SARS-CoV-2, מכיל חלבוני ספייק, וגודלו דומה (80-100 ננומטר)³⁴, לכל הבדיקות. מאחר ש-Phi6 אינו פתוגן ידוע, ניתן לתמרן אותו במעבדה מיקרוביולוגית כללית לביו-בטיחות ברמה 1 (BSL-1). יעילות נגד Phi6 עשויה להצביע על יעילותם של וירוסים עטופים אחרים, עם זאת, אימות אמפירי עבור כל וירוס מעניין הוא הכרחי³⁵. על ידי שימוש בחומר נגיפי דומה, לא פתוגני, יש לקוות שניתן יהיה לחזור על פרוטוקול זה במקומות אחרים ולהשתמש בו לחקר מגיפות/מגיפות ויראליות עתידיות. מחקרים עתידיים עשויים לכלול שימוש בחומרי חיטוי (למשל, אקונומיקה) בנוסף לדטרגנטים ופרוטוקול סטנדרטי לשטיפת ידיים וייבוש קווים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Freezer (- 80 °C)	ThermoFisher Scientific	FDE30086FA
Hot Plate	VWR	97042-714
Safety Pins (steel)	Singer	319921
Shaker	Lab-Line Instruments, Inc.	3525
SM buffer	Teknova,  Hollister, CA	S0249
Syringe filter (0.2 μm)	Corning, Corning, NY	PES syringe filters, 431229
1X Phosphate Buffered Saline	Teknova, Hollister, CA	P0196, 10X PBS solution
Agar	Becton Dickinson	214010
Autoclavable caps	DWK Life Sciences, Millville, NJ	KIM-KAP Caps, 73663-18
Autoclave	Steris	AMSCO 250LS Steam Sterilizer Model 20VS
Beef Extract	Sigma-Aldrich, Millipore Sigma, St. Louis, MO, USA	P/N B4888-100g
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	793639
Cell spreaders	Busse Hospital Disposables	23600894
Centrifuge	ThermoFisher Scientific	75004271	Heraeus MegaFuge 16R Centrifuge
Certified Timer	https://nist.time.gov/	Not Applicable
Conical tubes (50 mL)	Corning Life Sciences	352098	Falcon 50-mL high-clarity polypropylene conical centrifuge tubes
Cryovials	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	AY509X33
Denim	Wrangler	Rustler Regular Fit Straight Leg Jean Four Pocket Jean with Scoop Front Pockets, PN:87619PW
Detergent	Proctor and Gamble	Tide Original Scent Liquid Laundry Detergent Product Number (PN): 003700023068
Dextrose	Fisher	BP350
Dey-Engley neutralizing broth	Becton Dickinson	DF0819172
Dryer	Magic Chef	MCSDRY15W
Face Coverings	Felina	Reusable Organic Cotton Face Masks, PN: 990121P4
Incubator (top agar)	Symphony	414004-596
Laboratory Notebook	Scientific Notebook Company	2001
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M9272
Media sterilization and dispensing system	Integra	Media Clave/Media Jet
Petri Dishes (100 mm)	VWR	25384-342
pH Meter	Orion/Oakton	STARA1110/EW-35634-35
pH Probe	Orion	8157BNUMD
pH Standards	Oakton	00654-(00/04/08)
Phi 6 and Pseudomonas syringae	Battelle Memorial Institute, Columbus, OH	Not Applicable
Pipette & Tips	Rainin	(Pipettes) 17014391, 17002921; (Pipette Tips) 30389239, 17014382
Refrigerator	True Manufacturing Co., Inc.	GDM-33
Scrubs	Gogreen cool	PN: WS19100PT
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	57656
Stir Bar	Fisherbrand	16-800-512
Tape Measure	Lufkin	PS3425
Test Tubes for Soft agar (14 mL)	Corning, Corning, NY	352059
Thermometer	Fisherbrand	14-983-19B
Tryptone	Sigma-Aldrich	T9410
Vaporous hydrogen peroxide sterilization bags	STERIS	62020TW
Vortex (during the plating process)	Daigger Scientific, Inc	3030A	Vortex Genie 2
Vortex (for sample extraction)	Branson Ultrasonics	58816-115	Multi-Tube vortexer
Washer	Kuppet	KP1040600A
Washer Sterilization	Steris	STERIS VHP ED1000 generator
Yeast extract	Gibco	212750