Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
Ce protocole démontre l’utilisation d’un canal microfluidique avec une géométrie changeante le long de la direction d’écoulement du fluide pour générer une déformation d’extension (étirement) afin d’aligner les fibres dans un hydrogel de collagène 3D (<250 μm d’épaisseur). L’alignement résultant s’étend sur plusieurs millimètres et est influencé par la vitesse de déformation extensionnelle.
Les fibres de collagène I alignées (COL1) guident la motilité des cellules tumorales, influencent la morphologie des cellules endothéliales, contrôlent la différenciation des cellules souches et sont une caractéristique des tissus cardiaques et musculo-squelettiques. Pour étudier la réponse cellulaire aux microenvironnements alignés in vitro, plusieurs protocoles ont été développés pour générer des matrices COL1 avec un alignement défini des fibres, y compris des méthodes magnétiques, mécaniques, cellulaires et microfluidiques. Parmi celles-ci, les approches microfluidiques offrent des capacités avancées telles que le contrôle précis des flux de fluides et du microenvironnement cellulaire. Cependant, les approches microfluidiques pour générer des matrices COL1 alignées pour les plateformes de culture in vitro avancées ont été limitées à de minces « tapis » (<40 μm d’épaisseur) de fibres de COL1 qui s’étendent sur des distances inférieures à 500 μm et ne sont pas propices aux applications de culture cellulaire 3D. Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer des matrices COL1 3D (130-250 μm d’épaisseur) avec des régions millimétriques d’alignement de fibres définies dans un dispositif microfluidique. Cette plate-forme fournit des capacités avancées de culture cellulaire pour modéliser des microenvironnements tissulaires structurés en fournissant un accès direct à la matrice de micro-ingénierie pour la culture cellulaire.
Les cellules résident dans un réseau fibreux 3D complexe appelé matrice extracellulaire (ECM), dont la majeure partie est composée de la protéine structurelle collagène de type I (COL1)1,2. Les propriétés biophysiques de l’ECM fournissent des indices de guidage aux cellules et, en réponse, les cellules remodèlent la microarchitecture ECM 3,4,5. Ces interactions réciproques cellule-matrice peuvent donner naissance à des domaines fibreux COL1 alignés6 qui favorisent l’angiog....
1. Fabrication du canal en deux parties et de la base de plate-forme modulaire
REMARQUE: Le canal microfluidique est construit en deux parties: le canal microfluidique « découpe », qui est coupé au rasoir à partir d’une feuille de polydiméthylsiloxane (PDMS) d’épaisseur définie, et le couvercle du canal, qui se lie de manière réversible à la découpe et forme le canal. Le canal est entouré d’un cadre en poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA) qui agira comme u.......
Lorsqu’une solution de COL1 auto-assemblée s’écoule dans un canal dont la section transversale diminue, la vitesse du flux (v x) de la solution de COL1 augmente localement d’une magnitude, ∂v x, le long de la constriction entre les deux segments (∂x), ce qui entraîne une vitesse de déformation d’extension (ε̇) où ε̇ = ∂v x/∂x. Le taux de déformation d’extension peut être calculé à partir de la vitesse du fluide, qui est mesurée à l’aide de la vélocimét.......
Les protocoles de génération de matrices COL1 avec des fibres alignées ont été décrits à l’aide de méthodes magnétiques, de l’application directe de contraintes mécaniques et de techniques microfluidiques47. Les approches microfluidiques sont couramment utilisées pour créer des systèmes microphysiologiques en raison de leurs caractéristiques d’écoulement et de transport bien définies, qui permettent un contrôle précis du microenvironnement biochimique. Étant donné que les.......
Ce travail a été soutenu en partie par le National Institute of Health sous le numéro d’attribution R21GM143658 et par la National Science Foundation sous le numéro de subvention 2150798. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des organismes de financement.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
CT-FIRE software | LOCI - University of Wisconsin | ||
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
Laser cutter | Full Spectrum | 20x12 H-series | |
Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
Silicon wafer | University wafer | 452 | |
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
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