JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Bioengineering

מיקרו-הנדסה הידרוג'ל קולגן תלת-ממדית עם יישור סיבים לטווח ארוך

Published: September 7th, 2022

DOI:

10.3791/64457

1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

פרוטוקול זה מדגים את השימוש בתעלה מיקרופלואידית עם שינוי גיאומטריה לאורך כיוון זרימת הנוזל כדי ליצור מאמץ מאריך (מתיחה) ליישור סיבים בהידרוג'ל קולגן תלת-ממדי (עובי <250 מיקרומטר). היישור המתקבל משתרע על פני מספר מילימטרים ומושפע מקצב המאמץ המתארך.

סיבי קולגן I מיושרים (COL1) מנחים את תנועתיות תאי הגידול, משפיעים על המורפולוגיה של תאי האנדותל, שולטים בהתמיינות תאי גזע והם סימן ההיכר של רקמות הלב והשרירים-שלד. כדי לחקור את תגובת התאים למיקרו-סביבות מיושרות במבחנה, פותחו מספר פרוטוקולים ליצירת מטריצות COL1 עם יישור סיבים מוגדר, כולל שיטות מגנטיות, מכניות, מבוססות תאים ומיקרופלואידיות. מבין אלה, גישות מיקרופלואידיות מציעות יכולות מתקדמות כגון שליטה מדויקת על זרימת הנוזלים והמיקרו-סביבה התאית. עם זאת, הגישות המיקרופלואידיות ליצירת מטריצות COL1 מיושרות עבור פלטפורמות מתקדמות של תרביות חוץ גופיות הוגבלו ל"מחצלות" דקות (<40 מיקרומטר עובי) של סיבי COL1 המשתרעים על פני מרחקים של פחות מ-500 מיקרומטר ואינם תורמים ליישומי תרביות תאים תלת-ממדיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור מטריצות 3D COL1 (130-250 מיקרומטר עובי) עם אזורים בקנה מידה מילימטרי של יישור סיבים מוגדר במכשיר מיקרופלואידי. פלטפורמה זו מספקת יכולות מתקדמות של תרביות תאים למדל מיקרו-סביבות רקמה מובנות על ידי מתן גישה ישירה למטריצה המהונדסת במיקרו עבור תרביות תאים.

התאים שוכנים ברשת סיבית תלת-ממדית מורכבת הנקראת מטריצה חוץ-תאית (ECM), שרובה מורכב מסוג קולגן חלבוני מבני I (COL1)1,2. התכונות הביופיזיקליות של ECM מספקות רמזי הנחיה לתאים, ובתגובה, תאים מעצבים מחדש את מיקרו-ארכיטקטורה ECM 3,4,5. אינטראקציות הדדיות אלה בין תאים למטריצות יכולות ליצור תחומי סיבים מיושרים של COL16 המקדמים אנגיוגנזה ופלישת תאים בסביבת הגידול 7,8,9 ומשפיעים על מורפולוגיה של התא

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. ייצור ערוץ שני חלקים ובסיס פלטפורמה מודולרי

הערה: התעלה המיקרופלואידית בנויה משני חלקים – "מגרעת" התעלה המיקרופלואידית, שהיא חיתוך תער מיריעת פולי דימתיל סילוקסאן (PDMS) בעובי מוגדר, וכיסוי התעלה, שנקשר באופן הפיך למגרעת ויוצר את התעלה. התעלה מוקפת במסגרת פולי(מתיל ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כאשר תמיסת COL1 בהרכבה עצמית זורמת דרך ערוץ עם שטח חתך הולך ופוחת, מהירות הזרם (v x) של תמיסת COL1 גדלה מקומית בגודל, ∂v x, לאורך ההתכווצות בין שני המקטעים (∂x), וכתוצאה מכך נוצר קצב מאמץ מאריך (ε̇) כאשר ε̇ = ∂v x/∂x. ניתן לחשב את קצב המאמץ המתרחב ממהירות הנוזל, אשר נמדדת באמצעות מהירו?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקולים ליצירת מטריצות COL1 עם סיבים מיושרים תוארו באמצעות שיטות מגנטיות, יישום ישיר של מתח מכני, וטכניקות מיקרופלואידיות47. גישות מיקרופלואידיות משמשות בדרך כלל ליצירת מערכות מיקרופיזיולוגיות בגלל מאפייני הזרימה וההובלה המוגדרים היטב שלהן, המאפשרים שליטה מדויקת על המיקר?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לבריאות תחת פרס מספר R21GM143658 ועל ידי הקרן הלאומית למדע תחת מענק מספר 2150798. התוכן הוא באחריות הכותבים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של הגופים המממנים.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES)Sigma Aldrich440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing TipJensen GlobalJG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated MagnetKJ MagneticsD31
3M (TC) 12X12-6-467MPDigiKey3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5%Signa Aldrich179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATERElectro-Technic Products12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa AesarVWRAAJ64100-09
Clear cast acrylic sheetMcMaster-Carr8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus TestedVWR45000-666
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CT-FIRE softwareLOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mLLonzaCC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mLVWRVWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50GraphtecCE LITE-50
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A DurometerMcMaster-Carr87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cellsThermo Fisher ScientificC0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher ScientificT10282
IsopropanolFisher ScientificA4154
Laser cutterFull Spectrum20x12 H-series
Microfluidics Syringe pumpNew Era Syringe PumpsNE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000EGilsonFD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH3570
Nutragen Bovine Atelo CollagenAdvanced BioMatrix5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4VWR70011044.00
PBS pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100Alfa AesarJ63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20USCUTTERGRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer SlipRestek22766.00
Silicon waferUniversity wafer452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 gVWRBDH9292-500G
Sylgard 184VWR102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20Thermo Fisher Scientific28352.00

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
  3. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  4. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  5. Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058 (2011).
  6. Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
  7. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  8. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11 (2008).
  9. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  10. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  11. Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
  12. Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107 (2018).
  13. Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
  14. Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
  15. Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780 (2019).
  16. Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323 (2018).
  17. Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
  18. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  19. Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506 (2018).
  20. Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016 (2017).
  21. Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
  22. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341 (2016).
  23. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
  24. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769 (2022).
  25. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
  26. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
  28. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
  29. Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848 (2021).
  30. Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911 (2018).
  31. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
  32. Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
  33. Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276 (2021).
  34. Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
  35. Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
  36. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  37. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
  38. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
  39. Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
  40. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  41. Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931 (2020).
  42. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  43. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  44. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
  45. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  46. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
  47. Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).

Tags

187

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved