JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Bioengineering

लंबी दूरी के फाइबर संरेखण के साथ माइक्रोइंजीनियरिंग 3 डी कोलेजन हाइड्रोगेल

Published: September 7th, 2022

DOI:

10.3791/64457

1Department of Biomedical Engineering, Kate Gleason College of Engineering, Rochester Institute of Technology

यह प्रोटोकॉल 3 डी कोलेजन हाइड्रोगेल (मोटाई में <250 μm) में फाइबर को संरेखित करने के लिए विस्तारात्मक तनाव (स्ट्रेचिंग) उत्पन्न करने के लिए द्रव प्रवाह दिशा के साथ ज्यामिति को बदलने के साथ एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल के उपयोग को प्रदर्शित करता है। परिणामी संरेखण कई मिलीमीटर में फैला हुआ है और विस्तारात्मक तनाव दर से प्रभावित होता है।

संरेखित कोलेजन I (COL1) फाइबर ट्यूमर सेल गतिशीलता का मार्गदर्शन करते हैं, एंडोथेलियल सेल आकृति विज्ञान को प्रभावित करते हैं, स्टेम सेल भेदभाव को नियंत्रित करते हैं, और हृदय और मस्कुलोस्केलेटल ऊतकों की एक पहचान हैं। विट्रो में संरेखित माइक्रोएन्वायरमेंट के लिए सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए, चुंबकीय, यांत्रिक, सेल-आधारित और माइक्रोफ्लुइडिक विधियों सहित परिभाषित फाइबर संरेखण के साथ सीओएल 1 मैट्रिसेस उत्पन्न करने के लिए कई प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। इनमें से, माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण उन्नत क्षमताओं की पेशकश करते हैं जैसे द्रव प्रवाह और सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट पर सटीक नियंत्रण। हालांकि, उन्नत इन विट्रो कल्चर प्लेटफार्मों के लिए संरेखित सीओएल 1 मैट्रिसेस उत्पन्न करने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक दृष्टिकोण सीओएल 1 फाइबर के पतले "मैट" (<40 μm मोटाई) तक सीमित हैं जो 500 μm से कम दूरी तक फैले हुए हैं और 3 डी सेल कल्चर अनुप्रयोगों के लिए अनुकूल नहीं हैं। यहां, हम एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में परिभाषित फाइबर संरेखण के मिलीमीटर-स्केल क्षेत्रों के साथ 3 डी सीओएल 1 मैट्रिसेस (मोटाई में 130-250 μm) बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह मंच सेल संस्कृति के लिए माइक्रो-इंजीनियर मैट्रिक्स तक सीधी पहुंच प्रदान करके संरचित ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट को मॉडल करने के लिए उन्नत सेल कल्चर क्षमताएं प्रदान करता है।

कोशिकाएं एक जटिल 3 डी रेशेदार नेटवर्क में रहती हैं जिसे बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) कहा जाता है, जिसका बड़ा हिस्सा संरचनात्मक प्रोटीन कोलेजन प्रकार I (COL1)1,2 से बना होता है। ईसीएम के बायोफिज़िकल गुण कोशिकाओं को मार्गदर्शन संकेत प्रदान करते हैं, और जवाब में, कोशिकाएं ईसीएम माइक्रोआर्किटेक्चर 3,4,5 को फिर से तैयार करती हैं। ये पारस्परिक सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन संरेखित सीओएल 1 फाइबर डोमेन6 को जन्म दे सकते हैं जो ट्यूमर वातावरण 7,8,9

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. दो-टुकड़ा चैनल और मॉड्यूलर प्लेटफ़ॉर्म बेस का निर्माण

नोट: माइक्रोफ्लुइडिक चैनल का निर्माण दो भागों का उपयोग करके किया जाता है - माइक्रोफ्लुइडिक चैनल "कटआउट", जो परिभाषित मोटाई की पॉल?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

जब एक स्व-संयोजन COL1 समाधान घटते क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र के साथ एक चैनल के माध्यम से बहता है, तो COL1 समाधान का धारावार वेग (vx) स्थानीय रूप से एक परिमाण, ∂vx, दो खंडों (∂x) के बीच कसना की लंबाई के साथ बढ़ता है.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

संरेखित तंतुओं के साथ COL1 मैट्रिसेस उत्पन्न करने के प्रोटोकॉल को चुंबकीय विधियों, यांत्रिक तनाव के प्रत्यक्ष अनुप्रयोग और माइक्रोफ्लुइडिकतकनीकों का उपयोग करके वर्णित किया गया है। माइक्रोफ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

इस काम को पुरस्कार संख्या R21GM143658 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान और अनुदान संख्या 2150798 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था। सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि फंडिंग एजेंसियों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करती है।

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES)Sigma Aldrich440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing TipJensen GlobalJG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated MagnetKJ MagneticsD31
3M (TC) 12X12-6-467MPDigiKey3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5%Signa Aldrich179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATERElectro-Technic Products12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa AesarVWRAAJ64100-09
Clear cast acrylic sheetMcMaster-Carr8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus TestedVWR45000-666
Countess II Automated Cell CounterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CT-FIRE softwareLOCI - University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mLLonzaCC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mLVWRVWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50GraphtecCE LITE-50
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A DurometerMcMaster-Carr87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cellsThermo Fisher ScientificC0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher ScientificT10282
IsopropanolFisher ScientificA4154
Laser cutterFull Spectrum20x12 H-series
Microfluidics Syringe pumpNew Era Syringe PumpsNE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000EGilsonFD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, TrihydrateThermo Fisher ScientificH3570
Nutragen Bovine Atelo CollagenAdvanced BioMatrix5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4VWR70011044.00
PBS pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100Alfa AesarJ63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20USCUTTERGRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer SlipRestek22766.00
Silicon waferUniversity wafer452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 gVWRBDH9292-500G
Sylgard 184VWR102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20Thermo Fisher Scientific28352.00

  1. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  2. Bosman, F. T., Stamenkovic, I. Functional structure and composition of the extracellular matrix. The Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).
  3. Cox, T. R., Erler, J. T. Remodeling and homeostasis of the extracellular matrix: Implications for fibrotic diseases and cancer. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 165-178 (2011).
  4. Cross, V. L., et al. Dense type I collagen matrices that support cellular remodeling and microfabrication for studies of tumor angiogenesis and vasculogenesis in vitro. Biomaterials. 31 (33), 8596-8607 (2010).
  5. Lu, P., Takai, K., Weaver, V. M., Werb, Z. Extracellular matrix degradation and remodeling in development and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (12), 005058 (2011).
  6. Piotrowski-Daspit, A. S., Nerger, B. A., Wolf, A. E., Sundaresan, S., Nelson, C. M. Dynamics of tissue-induced alignment of fibrous extracellular matrix. Biophysical Journal. 113 (3), 702-713 (2017).
  7. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Medicine. 4 (1), 38 (2006).
  8. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Medicine. 6 (1), 11 (2008).
  9. Szulczewski, J. M., et al. Directional cues in the tumor microenvironment due to cell contraction against aligned collagen fibers. Acta Biomaterialia. 129, 96-109 (2021).
  10. Aubin, H., et al. Directed 3D cell alignment and elongation in microengineered hydrogels. Biomaterials. 31 (27), 6941-6951 (2010).
  11. Gruschwitz, R., et al. Alignment and cell-matrix interactions of human corneal endothelial cells on nanostructured collagen type I matrices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (12), 6303-6310 (2010).
  12. Wang, W. Y., et al. Extracellular matrix alignment dictates the organization of focal adhesions and directs uniaxial cell migration. APL Bioengineering. 2 (4), 046107 (2018).
  13. Wang, W. Y., Lin, D., Jarman, E. H., Polacheck, W. J., Baker, B. M. Functional angiogenesis requires microenvironmental cues balancing endothelial cell migration and proliferation. Lab on a Chip. 20 (6), 1153-1166 (2020).
  14. Lanfer, B. The growth and differentiation of mesenchymal stem and progenitor cells cultured on aligned collagen matrices. Biomaterials. 30 (30), 5950-5958 (2009).
  15. Brauer, E., et al. Collagen fibrils mechanically contribute to tissue contraction in an in vitro wound healing scenario. Advanced Science. 6 (9), 1801780 (2019).
  16. Ingber, D. E. From mechanobiology to developmentally inspired engineering. PhilosophicalTransactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1759), 20170323 (2018).
  17. Wang, H., Abhilash, A. S., Chen, C. S., Wells, R. G., Shenoy, V. B. Long-range force transmission in fibrous matrices enabled by tension-driven alignment of fibers. Biophysical Journal. 107 (11), 2592-2603 (2014).
  18. Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical Journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
  19. Ahadian, S., et al. Organ-on-a-chip platforms: A convergence of advanced materials, cells, and microscale technologies. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), 1700506 (2018).
  20. Hou, X., et al. Interplay between materials and microfluidics. Nature Reviews Materials. 2 (5), 17016 (2017).
  21. Abhyankar, V. V., et al. A platform for assessing chemotactic migration within a spatiotemporally defined 3D microenvironment. Lab on a Chip. 8 (9), 1507-1515 (2008).
  22. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A reversibly sealed, easy access, modular (SEAM) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLoS One. 11 (5), 0156341 (2016).
  23. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (RID) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
  24. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12, 10769 (2022).
  25. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab on a Chip. 12 (12), 2156-2164 (2012).
  26. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
  28. Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Physical Chemistry. 1, 423-449 (2008).
  29. Ma, Y., et al. Viscoelastic cell microenvironment: Hydrogel-based strategy for recapitulating dynamic ECM mechanics. Advanced Functional Materials. 31 (24), 2100848 (2021).
  30. Ma, Y., et al. 3D spatiotemporal mechanical microenvironment: A hydrogel-based platform for guiding stem cell fate. Advanced Materials. 30 (49), 1705911 (2018).
  31. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomedical Microdevices. 8 (1), 35-41 (2006).
  32. Del Amo, C., Borau, C., Movilla, N., Asín, J., García-Aznar, J. M. Quantifying 3D chemotaxis in microfluidic-based chips with step gradients of collagen hydrogel concentrations. Integrative Biology. 9 (4), 339-349 (2017).
  33. Shi, N., et al. A 3D, magnetically actuated, aligned collagen fiber hydrogel platform recapitulates physical microenvironment of myoblasts for enhancing myogenesis. Small Methods. 5 (6), 2100276 (2021).
  34. Lanfer, B., et al. Aligned fibrillar collagen matrices obtained by shear flow deposition. Biomaterials. 29 (28), 3888-3895 (2008).
  35. Saeidi, N., Sander, E. A., Ruberti, J. W. Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials. 30 (34), 6581-6592 (2009).
  36. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomaterialia. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  37. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
  38. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
  39. Mansouri, M., et al. The modular µSiM reconfigured: Integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. , (2022).
  40. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: a potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  41. Liu, Y., Eliceiri, K. W. Quantifying fibrillar collagen organization with curvelet transform-based tools. Journal of Visualized Experiments. (165), e61931 (2020).
  42. Bredfeldt, J. S., et al. Automated quantification of aligned collagen for human breast carcinoma prognosis. Journal of Pathology Informatics. 5 (1), 28 (2014).
  43. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 016007 (2014).
  44. Carey, S. P., et al. Local extracellular matrix alignment directs cellular protrusion dynamics and migration through Rac1 and FAK. Integrative Biology. 8 (8), 821-835 (2016).
  45. Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
  46. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. AmericanJournal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), 1112-1124 (2021).
  47. Mohammadi, H., Janmey, P. A., McCulloch, C. A. Lateral boundary mechanosensing by adherent cells in a collagen gel system. Biomaterials. 35 (4), 1138-1149 (2014).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved