Idrogel di collagene 3D di microingegneria con allineamento delle fibre a lungo raggio

Questo protocollo dimostra l'uso di un canale microfluidico con geometria variabile lungo la direzione del flusso del fluido per generare tensione estensionale (stretching) per allineare le fibre in un idrogel di collagene 3D (<250 μm di spessore). L'allineamento risultante si estende su diversi millimetri ed è influenzato dalla velocità di deformazione estensionale.

Le fibre di collagene I allineato (COL1) guidano la motilità delle cellule tumorali, influenzano la morfologia delle cellule endoteliali, controllano la differenziazione delle cellule staminali e sono un segno distintivo dei tessuti cardiaci e muscoloscheletrici. Per studiare la risposta cellulare a microambienti allineati in vitro, sono stati sviluppati diversi protocolli per generare matrici COL1 con allineamento delle fibre definito, inclusi metodi magnetici, meccanici, cellulari e microfluidici. Di questi, gli approcci microfluidici offrono funzionalità avanzate come un controllo accurato dei flussi di fluidi e del microambiente cellulare. Tuttavia, gli approcci microfluidici per generare matrici COL1 allineate per piattaforme di coltura in vitro avanzate sono stati limitati a sottili "tappetini" (<40 μm di spessore) di fibre COL1 che si estendono su distanze inferiori a 500 μm e non sono favorevoli alle applicazioni di coltura cellulare 3D. Qui, presentiamo un protocollo per fabbricare matrici 3D COL1 (130-250 μm di spessore) con regioni su scala millimetrica di allineamento delle fibre definito in un dispositivo microfluidico. Questa piattaforma fornisce funzionalità avanzate di coltura cellulare per modellare microambienti tissutali strutturati fornendo accesso diretto alla matrice microingegnerizzata per la coltura cellulare.

Le cellule risiedono in una complessa rete fibrosa 3D chiamata matrice extracellulare (ECM), la maggior parte della quale è composta dalla proteina strutturale collagene di tipo I (COL1)^1,2. Le proprietà biofisiche dell'ECM forniscono indicazioni alle cellule e, in risposta, le cellule rimodellano la microarchitettura ECM ^3,4,5. Queste interazioni reciproche cellula-matrice possono dare origine a domini di fibre COL1 allineati⁶ che promuovono l'angiogenesi e l'invasione ce....

1. Fabbricazione del canale a due pezzi e della base della piattaforma modulare

NOTA: Il canale microfluidico è costruito utilizzando due parti: il "cutout" del canale microfluidico, che è tagliato a rasoio da un foglio di polidimetil silossano (PDMS) di spessore definito e il coperchio del canale, che si lega reversibilmente al ritaglio e forma il canale. Il canale è circondato da un telaio in poli(metacrilato di metile) (PMMA) che fungerà da serbatoio di supporti (

Quando una soluzione COL1 autoassemblante scorre attraverso un canale con area di sezione trasversale decrescente, la velocità del flusso (v x) della soluzione di COL1 aumenta localmente di una grandezza, ∂v x, lungo la lunghezza della costrizione tra i due segmenti (∂x), risultando in una velocità di deformazione estensionale (ε̇) dove ε̇ = ∂v x/∂_x. La velocità di deformazione estensionale può essere calcolata dalla velocità del fluido, che viene misurata utilizzando la .......

I protocolli per generare matrici COL1 con fibre allineate sono stati descritti utilizzando metodi magnetici, l'applicazione diretta di deformazioni meccaniche e tecniche microfluidiche⁴⁷. Gli approcci microfluidici sono comunemente usati per creare sistemi microfisiologici a causa delle loro caratteristiche di flusso e trasporto ben definite, che consentono un controllo preciso sul microambiente biochimico. Poiché le fibre COL1 allineate forniscono segnali istruttivi chiave durante i processi fi.......

Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal National Institute of Health con il numero di premio R21GM143658 e dalla National Science Foundation con il numero di sovvenzione 2150798. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale delle agenzie di finanziamento.