Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
Detta protokoll demonstrerar användningen av en mikrofluidisk kanal med förändrad geometri längs vätskeflödesriktningen för att generera förlängningstöjning (sträckning) för att justera fibrer i en 3D-kollagenhydrogel (<250 μm i tjocklek). Den resulterande inriktningen sträcker sig över flera millimeter och påverkas av förlängningstöjningshastigheten.
Justerade kollagen I (COL1) fibrer styr tumörcellens rörlighet, påverkar endotelcellmorfologi, kontrollerar stamcellsdifferentiering och är ett kännetecken för hjärt- och muskuloskeletala vävnader. För att studera cellrespons på anpassade mikromiljöer in vitro har flera protokoll utvecklats för att generera COL1-matriser med definierad fiberinriktning, inklusive magnetiska, mekaniska, cellbaserade och mikrofluidiska metoder. Av dessa erbjuder mikrofluidiska metoder avancerade funktioner som noggrann kontroll över vätskeflöden och den cellulära mikromiljön. De mikrofluidiska metoderna för att generera anpassade COL1-matriser för avancerade in vitro-odlingsplattformar har dock begränsats till tunna "mattor" (<40 μm i tjocklek) av COL1-fibrer som sträcker sig över avstånd mindre än 500 μm och inte bidrar till 3D-cellodlingsapplikationer. Här presenterar vi ett protokoll för att tillverka 3D COL1-matriser (130-250 μm i tjocklek) med millimeterskaleregioner med definierad fiberinriktning i en mikrofluidisk enhet. Denna plattform ger avancerade cellodlingsfunktioner för att modellera strukturerade vävnadsmikromiljöer genom att ge direkt tillgång till den mikrokonstruerade matrisen för cellodling.
Celler finns i ett komplext 3D-fibröst nätverk som kallas extracellulär matris (ECM), varav huvuddelen består av det strukturella proteinet kollagen typ I (COL1)1,2. De biofysiska egenskaperna hos ECM ger vägledande ledtrådar till celler, och som svar omformar celler ECM-mikroarkitekturen 3,4,5. Dessa ömsesidiga cell-matrisinteraktioner kan ge upphov till anpassade COL1-fiberdomäner6 som främjar angiogenes och cellinvasion i tumörmiljön 7,8,9 och på....
1. Tillverkning av den tvådelade kanalen och modulära plattformsbasen
OBS: Den mikrofluidiska kanalen är konstruerad med två delar - den mikrofluidiska kanalen "cutout", som är rakhyvel skuren från ett polydimetylsiloxan (PDMS) ark med definierad tjocklek och kanalkåpan, som reversibelt binder till utskärningen och bildar kanalen. Kanalen är omgiven av en poly(metylmetakrylat) (PMMA) ram som kommer att fungera som en mediereservoar (figur 1.......
När en självmonterande COL1-lösning strömmar genom en kanal med minskande tvärsnittsarea ökar COL1-lösningens strömvisa hastighet (v x) lokalt med en storlek, ∂v x, längs längden på förträngningen mellan de två segmenten (∂x), vilket resulterar i en förlängningstöjningshastighet (ε̇) där ε̇ = ∂v x / ∂x. Förlängningstöjningshastigheten kan beräknas från vätskehastigheten, som mäts med hjälp av partikelbildvelocimetri (PIV), som visas i
Protokoll för att generera COL1-matriser med inriktade fibrer har beskrivits med hjälp av magnetiska metoder, direkt tillämpning av mekanisk töjning och mikrofluidiska tekniker47. Mikrofluidiska metoder används ofta för att skapa mikrofysiologiska system på grund av deras väldefinierade flödes- och transportegenskaper, vilket möjliggör exakt kontroll över den biokemiska mikromiljön. Eftersom anpassade COL1-fibrer ger viktiga lärorika signaler under patofysiologiska processer som sår.......
Detta arbete stöddes delvis av National Institute of Health under tilldelningsnummer R21GM143658 och av National Science Foundation under bidragsnummer 2150798. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis finansiärernas officiella åsikter.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
CT-FIRE software | LOCI - University of Wisconsin | ||
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
Laser cutter | Full Spectrum | 20x12 H-series | |
Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
Silicon wafer | University wafer | 452 | |
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved