Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
Bu protokol, lifleri bir 3D kollajen hidrojel (kalınlığı <250 μm) hizalamak için uzatma gerinim (germe) oluşturmak için sıvı akış yönü boyunca değişen geometriye sahip bir mikroakışkan kanalın kullanımını göstermektedir. Ortaya çıkan hizalama birkaç milimetre boyunca uzanır ve uzatma gerinim hızından etkilenir.
Hizalanmış kollajen I (COL1) lifleri tümör hücresi motilitesine rehberlik eder, endotel hücre morfolojisini etkiler, kök hücre farklılaşmasını kontrol eder ve kalp ve kas-iskelet sistemi dokularının ayırt edici özelliğidir. İn vitro hizalanmış mikro ortamlara hücre tepkisini incelemek için, manyetik, mekanik, hücre tabanlı ve mikroakışkan yöntemler de dahil olmak üzere tanımlanmış fiber hizalamasına sahip COL1 matrisleri üretmek için çeşitli protokoller geliştirilmiştir. Bunlardan mikroakışkan yaklaşımlar, sıvı akışları ve hücresel mikro çevre üzerinde doğru kontrol gibi gelişmiş yetenekler sunar. Bununla birlikte, gelişmiş in vitro kültür platformları için hizalanmış COL1 matrisleri oluşturmaya yönelik mikroakışkan yaklaşımlar, 500 μm'den daha az mesafelere yayılan ve 3D hücre kültürü uygulamalarına elverişli olmayan COL1 liflerinin ince "paspasları" (<40 μm kalınlığında) ile sınırlandırılmıştır. Burada, mikroakışkan bir cihazda tanımlanmış fiber hizalamasının milimetre ölçekli bölgelerine sahip 3D COL1 matrislerini (130-250 μm kalınlığında) üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu platform, hücre kültürü için mikro mühendislik matrisine doğrudan erişim sağlayarak yapılandırılmış doku mikro ortamlarını modellemek için gelişmiş hücre kültürü yetenekleri sağlar.
Hücreler, hücre dışı matris (ECM) adı verilen karmaşık bir 3D fibröz ağda bulunur ve bunların büyük kısmı yapısal protein kollajen tip I (COL1)1,2'den oluşur. ECM'nin biyofiziksel özellikleri, hücrelere rehberlik ipuçları sağlar ve buna cevaben, hücreler ECM mikromimarisiniyeniden şekillendirir 3,4,5. Bu karşılıklı hücre-matriks etkileşimleri,tümör ortamında anjiyogenezi ve hücre invazyonunu teşvik eden hizalanmış COL1 lif alanları6'ya yo....
1. İki parçalı kanal ve modüler platform tabanının imalatı
NOT: Mikroakışkan kanal iki parça kullanılarak inşa edilmiştir - tanımlanmış kalınlıkta bir poli dimetil siloksan (PDMS) levhadan jiletle kesilen mikroakışkan kanal "kesme" ve kesime geri dönüşümlü olarak bağlanan ve kanalı oluşturan kanal kapağı. Kanal, bir ortam rezervuarı görevi görecek bir poli (metil metakrilat) (PMMA) çerçevesi ile çevrilidir (Şekil 1
Kendiliğinden birleşen bir COL1 çözeltisi, kesit alanı azalan bir kanaldan aktığında, COL1 çözeltisinin akış hızı (v x), iki segment (∂x) arasındaki daralmanın uzunluğu boyunca yerel olarak bir büyüklük∂te, v x ile artar ve ε̇ = ∂v x/∂x olan bir uzatma gerinim oranı (ε̇) ile sonuçlanır. Ekstansiyonel gerinim oranı, Şekil 2'de görüldüğü gibi parçacık görüntü velosimetrisi (PIV) kullanılarak ölçülen sıvı hız.......
Hizalanmış liflerle COL1 matrisleri oluşturmak için protokoller, manyetik yöntemler, mekanik gerinimin doğrudan uygulanması ve mikroakışkan teknikler kullanılarak tanımlanmıştır47. Mikroakışkan yaklaşımlar, biyokimyasal mikro çevre üzerinde hassas kontrol sağlayan iyi tanımlanmış akış ve taşıma özellikleri nedeniyle mikrofizyolojik sistemler oluşturmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. Hizalanmış COL1 lifleri, yara iyileşmesi, tümör hücresi invazyonu ve d.......
Bu çalışma kısmen R21GM143658 ödül numarası altında Ulusal Sağlık Enstitüsü ve 2150798 hibe numarası altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve finansman kuruluşlarının resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
CT-FIRE software | LOCI - University of Wisconsin | ||
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
Laser cutter | Full Spectrum | 20x12 H-series | |
Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
Silicon wafer | University wafer | 452 | |
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved