Manipolazione dell'assunzione ritmica di cibo nei topi utilizzando un sistema di alimentazione personalizzato

Riepilogo

Limitare i tempi di assunzione del cibo è emerso come un intervento promettente per attenuare le malattie metaboliche indotte dalla dieta. Questo manoscritto descrive in dettaglio la costruzione e l'uso di un sistema efficiente costruito internamente per misurare e manipolare l'assunzione ritmica di cibo nei topi.

Abstract

L'espressione genica ritmica è un segno distintivo del ritmo circadiano ed è essenziale per guidare la ritmicità delle funzioni biologiche al momento appropriato della giornata. Gli studi degli ultimi decenni hanno dimostrato che l'assunzione ritmica di cibo (cioè il momento in cui gli organismi mangiano cibo durante il giorno di 24 ore), contribuisce in modo significativo alla regolazione ritmica dell'espressione genica in vari organi e tessuti in tutto il corpo. Gli effetti dell'assunzione ritmica di cibo sulla salute e sulla fisiologia sono stati ampiamente studiati da allora e hanno rivelato che limitare l'assunzione di cibo per 8 ore durante la fase attiva attenua le malattie metaboliche derivanti da una varietà di diete obesogeniche. Questi studi spesso richiedono l'uso di metodi controllati per la tempistica della consegna del cibo agli animali. Questo manoscritto descrive la progettazione e l'uso di un sistema a basso costo ed efficiente, costruito internamente per misurare il consumo giornaliero di cibo e manipolare l'assunzione ritmica di cibo nei topi. Questo sistema prevede l'utilizzo di materie prime a prezzi accessibili per costruire gabbie adatte alla consegna di cibo, seguendo una procedura di manipolazione user-friendly. Questo sistema può essere utilizzato in modo efficiente per nutrire i topi con diversi regimi di alimentazione come ad libitum, programmi a tempo limitato o aritmici e può incorporare una dieta ricca di grassi per studiarne l'effetto sul comportamento, sulla fisiologia e sull'obesità. Viene fornita una descrizione di come i topi wild-type (WT) si adattano ai diversi regimi di alimentazione.

Introduzione

L'orologio circadiano si trova ovunque tra le specie e fornisce un meccanismo di cronometraggio che aiuta gli organismi ad adattarsi al loro ambiente che cambia ritmicamente. Il pacemaker circadiano principale si trova nel nucleo soprachiasmatico (SCN) dell'ipotalamo. L'SCN è principalmente legato al ciclo luce-buio ambientale e sincronizza gli orologi periferici presenti in quasi tutte le cellule del corpo tramite segnali multipli, inclusi segnali neuronali e ormonali, alimentazione e temperatura corporea 1,2,3,4,5,6,7,8 . Nei mammiferi, l'orologio circadiano molecolare si basa sul fattore di trascrizione eterodimerico CLOCK: BMAL1 9,10, che controlla l'espressione dei geni dell'orologio del nucleo chiamati Periodo (Per1, Per2 e Per3) e Criptocromo (Cry1 e Cry2) per avviare un ciclo di feedback trascrizionale che è fondamentale per la generazione dei ritmi circadiani 9,11,12 . L'orologio molecolare regola anche la trascrizione ritmica di migliaia di geni che controllano la ritmicità di praticamente ogni funzione biologica^13,14,15. Più del 50% del genoma nei mammiferi è espresso ritmicamente in almeno un tipo di tessuto 16,17,18, e tessuti come il fegato nei topi hanno circa il 25%-30% del loro trascrittoma espresso ritmicamente^18,19. L'espressione genica ritmica è fondamentale per attivare importanti processi biologici come il controllo del ciclo cellulare²⁰, l'omeostasi del glucosio 21 e il metabolismo degli aminoacidi²² al momento giusto della giornata al fine di aumentare la forma fisica dell'organismo.

Negli ultimi decenni, ci sono state prove crescenti che suggeriscono che l'assunzione di cibo può agire come un potente segnale di sincronizzazione per trascinare i ritmi nell'espressione genica in più tessuti, incluso il fegato^23,24. È importante sottolineare che l'alimentazione ha dimostrato di intrappolare i ritmi nel fegato indipendentemente dall'SCN o dal ciclo luce-buio²⁵, e l'alimentazione ritmica può guidare l'espressione genica ritmica senza coinvolgere l'orologio molecolare 26,27,28,29,30,31. L'alimentazione limitata al periodo inattivo dei topi (diurno) inverte la fase di espressione dei geni del core clock e di molti geni ritmici³¹. L'alimentazione a tempo limitato (TRF), che è un intervento nutrizionale in cui l'apporto calorico giornaliero è limitato a un periodo di 8-10 ore, ha dimostrato di proteggere contro l'obesità, l'iperinsulinemia, la steatosi epatica e la sindrome metabolica^32,33. Tutti gli esperimenti di cui sopra che coinvolgono la manipolazione dell'assunzione di cibo richiedono allo sperimentatore di utilizzare metodi efficaci per consegnare il cibo al momento giusto della giornata.

Sono stati sviluppati diversi metodi di consegna degli alimenti, che presentano diversi vantaggi e svantaggi 29,34,35,36,37,38,39 (Tabella 1). Alcuni alimentatori automatici sono stati progettati per funzionare sulla base di un software che controlla la quantità, la durata e i tempi della disponibilità di cibo mentre registra l'alimentazione e l'attività volontaria di corsa delle ruote nei topi³⁴. Alcuni altri metodi prevedono che i topi vengano collocati in gabbie diverse per diverse condizioni di alimentazione, con lo sperimentatore che aggiunge manualmente pellet di cibo al momento prerequisito^38,39. Un altro sistema utilizza un sistema di alimentazione automatizzato controllato da un computer in cui uno schermo pneumatico impedisce l'accesso al cibo e che può essere controllato da intervalli di tempo o massa di cibo³⁵. Tutti questi metodi richiedono l'utilizzo e la configurazione di un software computerizzato che può essere costoso e richiedono una certa formazione per il corretto funzionamento dello strumento o sono laboriosi perché lo sperimentatore deve essere presente in momenti specifici per modificare manualmente le condizioni di alimentazione. Anche i sistemi computerizzati hanno la loro parte di problemi, tra cui il malfunzionamento delle leve o delle porte che lasciano uscire il cibo, i pellet di cibo che rimangono bloccati nelle prese e il guasto del software. Inoltre, il suono che può essere prodotto durante l'apertura di porte o leve presenta il rischio di condizionare i topi ad associarli alla consegna del cibo, compromettendo così l'interpretazione degli effetti della manipolazione alimentare come strettamente dovuti all'accesso al cibo o dovuti agli effetti su altri ritmi comportamentali come il ciclo sonno/veglia. L'obiettivo generale di questo studio era quello di sviluppare un sistema economico ed efficiente per manipolare l'assunzione ritmica di cibo a lungo termine che avrebbe contribuito ad alleviare molti di questi problemi di cui sopra. Innanzitutto, l'apparato di alimentazione sviluppato e descritto di seguito può essere costruito a un costo molto minimo rispetto alle macchine automatizzate (Tabella 2) e non richiede una formazione sofisticata per la movimentazione, il funzionamento e la manutenzione. In secondo luogo, il sistema di alimentazione produce solo un rumore bianco di fondo e nessun suono forte durante la consegna del cibo, prevenendo così il condizionamento pavloviano. Nel complesso, questo sistema di alimentazione è economico, più accessibile e affidabile per i ricercatori, pur essendo efficiente nella manipolazione dell'assunzione ritmica di cibo.

Protocollo

Tutti i soggetti animali sono utilizzati in conformità con le linee guida stabilite dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Texas A & M University (AUP # 2022-0050). Qui vengono utilizzati topi C57BL / 6 maschi e femmine di età compresa tra 2-4 mesi. La procedura per la costruzione del sistema di alimentazione è descritta di seguito e le materie prime necessarie per costruire l'apparato sono referenziate nella tabella dei materiali.

1. Costruzione del sistema di alimentazione

1. Costruzione di una base di cloruro di polivinile (PVC)
   1. Procurati quattro pezzi di fogli in PVC da 0,25 pollici tagliati secondo le seguenti dimensioni: 4,875 pollici x 4,5 pollici; 4,875 pollici x 2,125 pollici; 9,5 pollici x 2,125 pollici (due pezzi). Praticare quattro fori nella base da 4,875 pollici x 4,5 pollici per collegare un timer di 24 ore utilizzando le misurazioni fornite nella Figura 1A. Incollare i quattro pezzi di PVC per ottenere la base come in Figura 1A.
2. Fissaggio del timer sulla base in PVC
   1. Aprire il timer per rimuovere la spina. Effettuare una connessione utilizzando una prolunga/cavo elettrico standard (Figura 1B).
   2. Posizionare il timer sulla base in PVC per allinearla ai fori praticati sulla base al punto 1.1.1. Utilizzare viti da 1,5 pollici per fissare il timer sulla base in PVC. Assicurati che il timer sia piatto e stabile sulla base in PVC.
   3. Praticare quattro fori sulla parte superiore del timer e fissare viti da 0,75 pollici per contenere il contenitore per alimenti a otto scomparti (Figura 1B). La base per il sistema è completa e assomiglia alla Figura 1C.
      ATTENZIONE: Non praticare i fori attraverso l'intero timer.
3. Configurazione della gabbia
   1. Tagliare un tubo in PVC da 4 pollici (diametro esterno di 4,5 pollici) ad un'altezza di 3,125 pollici. Praticare un foro di circa 0,5 pollici sul fondo del tubo per far passare il cavo elettrico.
   2. Carteggiare la parte superiore del tubo (ad esempio, con un router o un utensile rotante) per consentire di rimuovere facilmente il tappo quando si cambia il contenitore per alimenti.
   3. Utilizzare una gabbia per mouse con una larghezza superiore a 4,5 pollici e tagliare un foro da 4,5 pollici nella parte inferiore della gabbia usando una sega a fori.
      NOTA: La posizione del foro dipende dalla configurazione della gabbia (ad esempio, posizione della parte superiore della gabbia e della bottiglia d'acqua, aggiunta di una ruota da corsa, ecc.).
4. Configurazione del contenitore di alimentazione
   1. Crea un distributore di cibo da un organizzatore di gioielli a otto scomparti da 4 pollici, come mostrato nella Figura 1D. Tagliare il bordo del contenitore in modo che si adatti bene al tubo.
   2. Utilizzare un tappo per tubi in PVC da 4 pollici e tagliare un foro corrispondente alle dimensioni di un singolo scomparto erogatore (ad esempio, con un utensile rotante) per creare un'apertura che espone solo uno degli otto scomparti alla volta. Mentre il timer si muove, l'apertura espone un nuovo vano ogni 3 ore. I componenti del sistema di alimentazione sono ora pronti per essere utilizzati. Una volta impostate tutte le gabbie, la configurazione finale è simile a quella mostrata nella Figura 1E.
   3. Il trasporto di molti contenitori per alimenti alla volta può essere ingombrante. Per facilitare il trasporto, prendi tre pezzi di tubo in PVC da 0,25 pollici. Praticare un foro da 0,625 pollici al centro di due pezzi e incollarli insieme. Quindi, utilizzare un tubo in PVC stretto da 0,625 pollici che si inserisce nel foro e attraverso il centro delle tazze per alimenti per impilare i bicchieri per alimenti per facilitarne il trasporto, come mostrato nella Figura 1F.
   4. Testare i timer prima di introdurre i topi collegando la configurazione alle prese di corrente, posizionando un pezzo di nestlet in uno scomparto in un momento registrato e monitorando la posizione del nestlet 12 ore dopo per assicurarsi che il timer giri prontamente.

2. Applicazione del sistema di alimentazione

1. Misurazione continua dell'assunzione di cibo nei topi
   1. Trasferire i topi nella stanza sperimentale e acclimatarli al ciclo luce-buio (LD) impostato nella stanza per almeno 1 settimana e per 2 settimane se il ciclo luce-buio viene spostato di oltre 3 ore. Per questo esperimento, i dati vengono raccolti da topi maschi e femmine C57BL / 6 tra 2-4 mesi di età esposti a LD 12: 12 (n = 7 maschi e 4 femmine).
   2. Registrare il peso dei topi prima di alloggiarli individualmente nelle gabbie di alimentazione (i pesi sono stati registrati alle 15:00, cioè al momento in cui sono stati effettuati i cambi di cibo). Assicurati che i topi abbiano accesso ad libitum all'acqua e abbastanza biancheria da letto e nidi.
   3. Aggiungere 1,5 g di cibo (45 mg di pellet di precisione senza polvere usati di routine) in tutti gli otto scomparti della tazza di alimentazione. Posizionare la tazza di alimentazione sul timer. Quindi, mettere il coperchio sulla tazza di alimentazione in modo tale che sia esposto un solo compartimento e annotare l'ora della presentazione del cibo. Quattro scomparti rappresentano i punti notturni e gli altri quattro rappresentano i punti diurni.
      NOTA: A causa del comportamento di accaparramento osservato sulla presentazione di cibo in eccesso, 1,5 g è stato ottimizzato come peso iniziale del cibo. I topi tendono ad accumulare pellet sopra i coperchi delle tazze di cibo o nella lettiera all'interno della gabbia. Ciò distorce i dati che portano alla sua errata interpretazione. I topi maschi non accumulano pellet se alimentati con 1,5 g o meno per compartimento. Le femmine tendono ad accumulare cibo più dei maschi, ma questo è specifico del topo e può essere attenuato se si fornisce 1 g di pellet per compartimento.
   4. Cambia cibo ogni giorno alla stessa ora e conta il numero di pellet rimanenti in ogni compartimento per calcolare la quantità di cibo consumato. Monitorare il profilo di alimentazione per una settimana per ottenere un profilo di alimentazione di base di topi nutriti ad libitum.
   5. Sulla base del cibo consumato in ogni compartimento, calcolare il consumo medio giornaliero di cibo per ciascun topo (Figura 2).
2. Trattamento dietetico ad alto contenuto di grassi (HFD)
   NOTA: Questo sistema di alimentazione può anche essere utilizzato per studiare l'effetto dell'HFD sulle malattie metaboliche ed eventualmente essere utilizzato per programmi di alimentazione limitati nel tempo. HFD non è disponibile in commercio come pellet di dimensioni e peso precisi e i pellet per l'alimentazione vengono solitamente acquistati come pellet da 0,5 pollici.
   1. Posizionare i pellet HFD su una superficie pulita o una pellicola trasparente e tagliarli in 6-7 pezzi più piccoli di dimensioni uniformi usando una lama di rasoio. Tagliare i pellet abbastanza piccoli in modo che assomiglino ai normali pellet di chow utilizzati nella sezione 2.1 sopra.
      NOTA: I topi tendono ad accumulare pellet più grandi nelle loro gabbie, portando a errori di calcolo del cibo consumato.
   2. Pesare 1,5 g di pezzi HFD tagliati e posizionarli in ciascuno degli 8 scomparti alimentari. Per il cambio di cibo a giorni alterni, sono sufficienti 1,5 g di HFD per compartimento.
   3. Cambia il cibo ogni giorno o a giorni alterni secondo le esigenze sperimentali e registra il peso del cibo che rimane.
   4. Calcola la quantità di cibo consumato sottraendo il peso rimanente del cibo dalla quantità iniziale di cibo dato. Ripetere questo processo per un periodo di 1 settimana per ottenere una linea di base di assunzione di cibo HFD (Figura 2).
3. Acclimatazione dei topi maschi a una dieta ristretta notturna (NR)
   1. Seguire i passaggi 2.1.1-2.1.4 per ottenere una linea di base di alimentazione ad libitum . Per questo esperimento, i dati vengono raccolti da topi maschi C57BL / 6 tra 2-4 mesi di età esposti a LD 12: 12 (n = 18 maschi).
   2. Dopo 3-7 giorni di dieta ad libitum , mettere i topi su una dieta di transizione riducendo gradualmente il numero di pellet nei compartimenti diurni. Per fare questo, avere cinque pellet per compartimento il giorno 1 di transizione (0,225 g per compartimento), 3 pellet il giorno 2 (0,135 g per compartimento), 1 pellet il giorno 3 (0,045 g per compartimento) e nessuno successivamente per la transizione completa dei topi su una dieta ristretta notturna.
      NOTA: Assicurarsi che i topi non siano soggetti a restrizioni caloriche. Calcola la media del consumo giornaliero di cibo dei topi per compartimento in base alla linea di base ad libitum e dai loro la stessa quantità di cibo, distribuendolo solo tra i compartimenti di quattro notti.
   3. Continua a monitorare l'assunzione di cibo per 2 settimane dopo che i topi si sono adattati al regime limitato notturno. Durante questo periodo, regolare la quantità di cibo somministrata a ciascun topo per adattarla meglio al suo consumo totale di cibo (Figura 3A). In genere aggiungere pellet di cibo (1 pellet per ciascuno dei quattro compartimenti notturni) quando i topi mangiano tutto il loro cibo per due notti consecutive.
   4. Pesare i topi alla fine del periodo di 2 settimane per monitorare qualsiasi cambiamento di peso dovuto al regime di alimentazione. Alla fine di questo periodo, anestetizzare i topi con isoflurano e eutanasizzarli per decapitazione. Raccogli i tessuti e analizzali per i cambiamenti quotidiani dovuti al paradigma alimentare.
4. Acclimatazione dei topi maschi a una dieta aritmica (AR)
   1. Seguire i passaggi 2.1.1-2.1.4 per ottenere una linea di base di alimentazione ad libitum . Per questo esperimento, i dati vengono raccolti da topi maschi C57BL / 6 tra 2-4 mesi di età esposti a LD 12: 12 (n = 18 maschi).
   2. Dopo una settimana di dieta ad libitum , calcola il consumo medio di cibo al giorno e dividi quel numero per 8 per ottenere la quantità di cibo da fornire in ogni compartimento. Ottieni l'alimentazione AR assicurando che i topi ricevano una quantità uguale di cibo in tutti e otto i compartimenti durante il giorno.
   3. Quindi, mettere i topi su una dieta di transizione riducendo gradualmente, nell'arco di 3-5 giorni, la quantità di cibo somministrato per compartimento per abolire definitivamente qualsiasi ritmo di assunzione di cibo (come mostrato in Figura 3B). Quando si segue una dieta AR, assicurarsi che i topi abbiano accesso a 1/8 del loro apporto giornaliero di cibo in ciascuno degli otto compartimenti, e quindi l'accesso al cibo ogni 3 ore. Assicurati che i topi non siano soggetti a restrizioni caloriche.
   4. Mantenere i topi sulla dieta AR per 2 settimane o più (Figura 3B).
   5. Durante la dieta AR, regolare il cibo ogni giorno per assicurarsi che i topi lascino solo pochi pellet (in genere meno di 5). Ciò garantisce che i topi ricevano la giusta quantità di cibo e non siano soggetti a restrizioni caloriche. Effettuare regolazioni riducendo o aggiungendo pellet in tutti gli otto compartimenti o riducendo o aggiungendo pellet in due compartimenti opposti, per non indurre alcun ritmo di assunzione di cibo.
      NOTA: I topi alimentati con una dieta AR lasciano il cibo quasi esclusivamente tra ZT3 e ZT9 (tra 3 h e 9 h dopo l'accensione della luce) ma hanno fame di notte e mordono il distributore di cibo per accedere al compartimento successivo. Tuttavia, i topi alimentati con AR non sono ipocalorici e in effetti guadagnano più peso dei topi nutriti con NR nel tempo.
   6. Pesare i topi alla fine del periodo di 2 settimane per monitorare qualsiasi cambiamento di peso dovuto al regime di alimentazione. Alla fine di questo periodo, anestetizzare i topi con isoflurano e eutanasizzarli per decapitazione. Raccogli i tessuti e analizzali per i cambiamenti quotidiani dovuti al paradigma alimentare.

Risultati

Il sistema di alimentazione sopra descritto può essere utilizzato per la manipolazione a lungo termine dell'assunzione ritmica di cibo nei topi. Questo sistema espone essenzialmente un nuovo compartimento alimentare al mouse ogni 3 ore consentendo al ricercatore di manipolare specificamente il cibo in ogni compartimento. Un'applicazione è stata quella di analizzare il profilo dell'assunzione di cibo nel periodo di 24 ore. I dati indicano che i topi WT alimentati con chow normale ad libitum mangiano circa il 75% del loro cibo durante la notte (Figura 2A). Inoltre, la maggior parte del cibo consumato durante il giorno avviene entro le 3 ore prima dello spegnimento della luce.

I topi alimentati con HFD ad libitum hanno mangiato più cibo nei primi 2 giorni di esposizione, probabilmente a causa della novità dell'HFD (Figura 2A). Dopo 2 giorni, l'assunzione di HFD è rimasta ritmica, ma con un'ampiezza ridotta rispetto a quando alimentata con normale chow ad libitum. Mentre sia i topi WT maschi che femmine sono stati nutriti con HFD, è stato riscontrato che i topi femmina hanno accumulato una grande quantità di cibo sul coperchio dell'apparato di alimentazione e nella gabbia, mentre i maschi non hanno mostrato alcun accaparramento evidente. Come accennato in precedenza, l'accaparramento di cibo può comportare un calcolo errato del consumo di cibo e portare a un'interpretazione errata dei dati. Inoltre, i topi femmina mordono più frequentemente i bordi di plastica delle tazze alimentari, specialmente nei compartimenti notturni. I topi maschi hanno mostrato un significativo aumento di peso dopo 1 settimana di chow normale ad libitum e dopo 1 settimana di HFD (Figura 2E). Una tendenza simile è stata osservata con i topi femmina, ma non ha raggiunto valori p significativi, probabilmente in parte a causa del minor numero di femmine utilizzate rispetto ai maschi.

I topi passati a una dieta NR mangiano le loro calorie totali giornaliere solo di notte, senza una significativa diminuzione dell'apporto calorico per le prime 3-5 settimane (Figura 3A). Un'esposizione più lunga al programma NR riduce l'apporto calorico medio giornaliero del 10% -15% rispetto ai topi alimentati ad libitum, come descritto altrove³⁴. I topi sono passati a una dieta AR hanno consumato le loro calorie totali giornaliere in quantità uguali durante il giorno, portando a un drammatico smorzamento del ritmo giornaliero di assunzione di cibo (Figura 3B). Per quanto riguarda il programma di alimentazione NR, la media giornaliera dell'apporto calorico non è influenzata dal programma di alimentazione AR per le prime 3-5 settimane di esposizione, ma diminuisce con un'esposizione più lunga. I topi hanno mostrato un aumento di peso dopo i programmi NR (Figura 3C) e AR (Figura 3C).

Figura 1: Progettazione e costruzione del sistema di apparecchi di alimentazione. (A) Le dimensioni della base in PVC per il sistema di alimentazione e la descrizione di dove devono essere praticati i fori per il fissaggio del timer. (B) Un timer di 24 ore prima e dopo il riutilizzo del filo e la perforazione con viti per il posizionamento del bicchiere di cibo. (C) La base grigia assemblata e il timer insieme a un tubo in PVC da 4 pollici. (D) La tazza per alimenti a otto scomparti dopo aver tagliato i bordi esterni. (E) La configurazione finale delle gabbie con la tazza per alimenti coperta da un cappuccio da 4 pollici in modo tale che sia accessibile un solo compartimento alla volta. (F) Il trasporto di più bicchieri alimentari durante un esperimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Profili di alimentazione in diversi regimi dietetici . (A) Il profilo di alimentazione dei topi maschi WT alimentati ad libitum con chow normale (NC) per 7 giorni e dieta ricca di grassi (HFD) per altri 7 giorni. Le linee colorate rappresentano i singoli profili del mouse (n = 7) e la linea nera indica il ± medio SEM di sette topi. (B) La dieta ricca di grassi prima e dopo l'affettamento. (C) La media giornaliera di assunzione di cibo ogni 3 ore ± SEM (n = 7). La media è stata calcolata negli ultimi 5 giorni del programma di alimentazione NC o HFD. (D) La media (a sinistra) e la percentuale (a destra) dell'assunzione di cibo durante il giorno e la notte per i topi alimentati con NC o HFD. I valori rappresentano la media di sette topi ± SEM e sono stati calcolati utilizzando i dati di assunzione di cibo negli ultimi 5 giorni dei programmi di alimentazione NC o HFD. * p < 0,05 tra i due gruppi (test t accoppiato). (E) Il peso corporeo medio dei topi utilizzati nell'esperimento dopo 1 settimana di NC e 1 settimana di HFD. I dati per maschi (a sinistra) e femmine (a destra) sono mostrati con * p < 0,05 tra i due gruppi (test t accoppiato). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Manipolazione del ritmo giornaliero dell'assunzione di cibo. (A) Il profilo di alimentazione dei topi maschi WT nutriti con chow normale ad libitum per 2 giorni, sono passati a un regime di alimentazione ristretto notturno (NR) per 3 giorni e mantenuti sotto alimentazione NR per 8 notti. Le linee colorate rappresentano i singoli profili del mouse (n = 18) e la linea nera indica il ± medio SEM di 18 topi. L'asterisco grigio indica il malfunzionamento del timer per quel mouse in quel singolo giorno in cui il timer ha smesso di girare. (B) Profilo di alimentazione di topi maschi WT nutriti con chow normale ad libitum per 2 giorni, passati a un regime di alimentazione aritmica (AR) per 1 giorno e mantenuti sotto alimentazione AR per 8 notti. Le linee colorate rappresentano i singoli profili del mouse (n = 18) e la linea nera indica il ± SEM medio dei 18 topi. (C) Il peso corporeo medio dei topi utilizzati nell'esperimento dopo 2 settimane di esposizione alle diete NR e AR. I dati sono mostrati con * p < 0,05 tra i due gruppi (test t accoppiato). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Vantaggi e svantaggi dei sistemi di alimentazione esistenti. Una tabella che evidenzia i diversi sistemi di alimentazione utilizzati per la manipolazione dell'assunzione di cibo, con una breve descrizione dei pro e dei contro di ciascun sistema. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Costo dei materiali necessari per costruire il sistema di alimentazione. Una tabella che elenca il costo degli articoli necessari per la costruzione del sistema di alimentazione descritto in questo documento insieme a una stima del costo di costruzione per gabbia. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Negli ultimi decenni sono state condotte ricerche approfondite sulla manipolazione dei ritmi alimentari e sul loro effetto sulla fisiologia. La costruzione e l'utilizzo del sistema di alimentazione qui descritto possono essere utilizzati come metodo efficiente per manipolare l'assunzione di cibo. Il protocollo utilizza un comune timer 24 ore su 24 e una tazza per alimenti progettata come organizzatore a otto scomparti come componenti chiave del sistema. Le gabbie possono essere costruite con facilità utilizzando pochi strumenti facilmente accessibili e la gestione del sistema è facile da usare. Alcuni degli aspetti chiave del protocollo per adattare il sistema per manipolare l'assunzione ritmica di cibo includono il cambio giornaliero delle tazze di cibo poiché il timer gira su un periodo di 24 ore, il conteggio manuale o la pesatura del cibo rimanente e la regolazione giornaliera del numero di pellet per l'alimentazione AR. In genere, i trucioli di plastica si vedono quando i topi hanno fame e non ricevono cibo adeguato. Questo problema può essere risolto aggiungendo qualche altro pellet alimentare che rispetta il regime di alimentazione fino a quando non si vedono trucioli di plastica. Nel caso dell'alimentazione AR, in cui il cibo quotidiano deve essere regolato, è necessario prestare attenzione a non indurre il ritmo di assunzione di cibo (Figura 3B). Quindi, è preferibile aggiungere o sottrarre pellet in compartimenti opposti per mantenere i topi alimentati aritmicamente.

Questo sistema può essere ulteriormente migliorato rivestendo i bicchieri alimentari con uno strato di resina epossidica per impedire ai topi di mordere la plastica e quindi contribuire a prolungare la vita dei bicchieri alimentari. La superficie del timer per il posizionamento della tazza di cibo può anche essere modificata per aiutare la tazza di cibo a sedersi piatta e stabile sul timer. Ciò potrebbe impedire l'arresto accidentale del timer causato da un timer posizionato in modo non uniforme. Alcuni dei componenti della gabbia, come le tazze alimentari, possono anche essere stampati in 3D per ridurre i costi e realizzati su misura a piacimento del ricercatore. Questo può includere tazze per alimenti con più di otto scomparti, che possono dare una risoluzione temporale migliore rispetto all'attuale finestra di 3 ore.

Sebbene molto efficiente, questo sistema ha alcune limitazioni, come ad alta intensità di lavoro, con il ricercatore che deve ancora cambiare le tazze di cibo ogni 24 ore e richiedere loro di contare / pesare manualmente il cibo rimanente. Inoltre, i timer devono essere monitorati di volta in volta per identificare potenziali problemi e / o se hanno smesso di funzionare. Ciò può essere ottenuto contando i pellet di cibo rimanenti dopo l'alimentazione (ad esempio, determinando se alcuni topi hanno mangiato cibo solo in pochi compartimenti e hanno lasciato intatti alcuni compartimenti). Un'altra limitazione di questo sistema è che potrebbe non funzionare altrettanto bene con i topi femmina, poiché i pochi esperimenti eseguiti con le femmine hanno dimostrato che tendono ad accumulare cibo e masticare la plastica più dei topi maschi.

Tuttavia, questo sistema di alimentazione è molto efficace nel manipolare l'assunzione di cibo, è facile da costruire, utilizzare, mantenere ed è economico rispetto ai costosi alimentatori automatici esistenti sul mercato. Può essere facilmente adattato e modificato per soddisfare le esigenze del ricercatore e non richiede alcuna formazione speciale per utilizzare il sistema. È importante sottolineare che i timer producono solo una bassa quantità di rumore bianco costante, che impedisce ai topi di associare qualsiasi suono alla disponibilità di cibo.

In sintesi, questo documento descrive un sistema di alimentazione innovativo che può essere utilizzato per monitorare il consumo quotidiano di cibo nei topi e può essere adattato per nutrire i topi su diversi paradigmi come l'alimentazione limitata nel tempo, l'alimentazione aritmica e l'alimentazione con una dieta ricca di grassi. Questo sistema si aggiunge all'elenco degli strumenti che possono essere utilizzati per affrontare questioni importanti nel campo dell'assunzione ritmica di cibo e del suo effetto sulla fisiologia.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
#6 x 0.75 inch Phillips Pan Head Stainless Steel Sheet Metal Screw (50-Pack)	Everbilt	#800172
#8 x 1.5 inch Phillips Pan Head Zinc Plated Sheet Metal Screw (100-Pack)	Everbilt	#801622
0.25 inch gray PVC sheet (24 inch x 48 inch)	USPlastic	#45088
4 inch PVC pipe (10 ft)	Home Depot	#531103
45 mg dustless precision pellets	Bio-Serv	#F0165
6 ft. Extension Cord	HDX	HD#145-017
Food container (eight-compartment jewelry organizer)	JewelrySupply	#PB8301
Indoor Basic Timer	General Electric	#15119
Oatey 4 inch ABS Pipe Test Cap with Knockout	Home Depot	#39103D
Rodent Diet with 45 kcal% fat (with red dye)	Research Diets	#D12451