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要約

ここでは、クレ マチディス・アルマンディ・カウリス とその偽和物の本物の品種を効果的に識別するための新しい戦略を提供する、化学的指紋マルチパターン認識と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を確立するためのプロトコルを提示します。

要約

漢方薬とその関連不純物を同定する方法は、 クレマチディス・アルマンディ・カリス (チュアンムトン、普遍的に使用されている伝統的な漢方薬)を例に構築されました。クラスター分析(CA)、主成分分析(PCA)、直交部分最小二乗弁別分析(OPLS-DA)を含むケモメトリックスと組み合わせた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)フィンガープリントに基づいて、本物のチュアンムトン品種の10バッチと関連する不純物の5バッチを分析および比較しました。さらに、β-シトステロールの含有量を測定した。チュアンムートンの対照化学的指紋が確立され、12の一般的なピークが特定されました。本物のチュアンムトン品種の10バッチの指紋と対照指紋の類似性は0.910〜0.989でしたが、5バッチの混入物の類似性はわずか0.133〜0.720でした。クロマトグラムの一般的なピークに基づいて、15バッチのサンプルがPCAによって3つの含有量レベルに分類され、CAによって4つのカテゴリに集約され、本物のチュアンムトンとチュアンムートンの不純物を明確に区別しました。さらに、OPLS-DAを通じて、本物のチュアンムトンとチュアンムトンの不純物を効果的に識別できる7つの差動成分が見つかりました。本物のチュアンムトン品種の10バッチのβ-シトステロール含有量は97.53-161.56μg / gでしたが、偽和物の5つのバッチのβ-シトステロール含有量は大きく異なり、その中で クレマチスペテラエ ハンドのβ-シトステロール含有量。と クレマチス・グリアナ・ ロクスブ。Var. finetii Rehd.エトウィルズ。チュアンムートンの本物の品種よりも大幅に低かった。本研究で確立されたHPLC指数成分含有量と化学指紋マルチパターン認識法は、本物の漢方薬材料および関連する不純物を効果的に識別するための新しい戦略を提供します。

概要

チュアンムトン、クレマチスアルマンディフランシュのドライカリス。またはクレマチスモンタナBuch.-Ham.は、クリニック1,2,3で一般的に使用される伝統的な漢方薬です。尿の問題、浮腫、舌や口の痛み、乳汁分泌の低下、関節のこわばり、湿った熱によって引き起こされる筋肉痛の治療に使用されます4。Chuanmutongは常に野生品種から得られており、主に中国南西部、特に四川省に分布しており、最高の品質が見られます5,6。本物の品種とそれらの密接に関連する不純物を区別することは困難です7,8,9,10。中国薬局方の2020年版のChuanmutongの品質基準は、含有量決定なしの特性、顕微鏡識別、および薄層識別のみを規定しており、偽和物を効果的に識別できないため、潜在的なリスクがあります。さらに、チュアンムトンと関連植物を比較および特定した報告はほとんどありません。したがって、チュアンムトンの信憑性を確保するための品質管理方法は、さらに研究する価値があります。

チュアンムートンの化学成分は、主にオレアナン型五環式トリテルペノイドとその配糖体、フラボノイド、および有機酸で構成されています11,12,13,14。その中で、オレアノール酸、β−シトステロール、スチグマステロール、およびエルゴステロールは、異なる強度の利尿作用を有し、これは、利尿を促進し、絞尿を緩和するための潜在的な薬力学的物質であり得る15,16。化学指紋は、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、ガスクロマトグラフィー(GC)などによってサンプルに含まれる多くの化学成分を分離して検出することによって得られます。Chuanmutongの特性を分析するために適切な統計分析方法を採用することで、伝統的な漢方薬の全体的な品質管理と科学的識別を決定できます17,18,19。

この研究では、チュアンムトン本物の品種の10バッチと偽和物の5バッチが収集されました。それらの品質は、クラスター分析(CA)、主成分分析(PCA)、直交部分最小二乗弁別分析(OPLS-CA)、および薬力学的成分の含有量決定を含むマルチパターン認識と組み合わせたHPLCフィンガープリント法によって比較および分析されました。このプロトコルは、高い特異性を持つ本物の品種を識別するための方法を確立し、本物の品種と中国の医薬品の不純物を科学的に識別するための新しい戦略を確立します。

プロトコル

1.化学的指紋検出方法

  1. クロマトグラフィー条件
    1. アセトニトリル(A)/水(B)移動相を準備します。HPLCソフトウェアで次のようにグラジエントプログラムを設定します:0-20分、3%A-10%A;20-25分、10%A-13%A;25-65分、13%A-25%A;65-75分、25%A-40%A;75-76分、40%A-3%A;76-85分、3%A-3%A。
    2. 移動相の流量を1.0 mL/分に維持します。
    3. 30°Cに維持したC18カラム(250 mm x 4.6 mm、5 μm)でクロマトグラフィー分離を行います。
    4. 注入量を10μLに設定します。
    5. 波長205nmのサンプルを検出します。
      注意: クロマトグラフィー条件の具体的な設定については、高速液体クロマトグラフィーの作業ソフトウェアの操作手順(材料表)を参照してください。
  2. 試料溶液の調製
    1. 原材料を内径850μm±29μmのナイロンメッシュに通して均一な粒子サイズに粉砕します。
    2. 粉砕した原料2 g(正確に秤量)をストッパー付きの50 mLコニカルフラスコに入れ、50 mLのメタノールを加える。フラスコにストッパーを置き、超音波処理(600 W、40 kHz)を30分間行います。
    3. その後、フラスコを室温(RT)まで冷却する。サンプルを再度計量し、失われた抽出剤を交換して初期重量を補います。
    4. 薬用抽出物を含むメタノール溶液4 mLを10 mLメスフラスコに注ぎます。6mLのH2Oを加えて混合し、10分間沈降させます。
    5. 最後に、上清を0.45μmのフィルターメンブレンでろ過し、スタンバイ状態にします。
  3. 指紋検出方法の検証
    1. 上記のようにサンプルを調製し(ステップ1.2)、1日6回HPLC分析(ステップ1.1)にかけます。精度を評価するには、ステップ1.3.5の説明に従って、相対保持時間と相対ピーク面積の相対標準偏差(RSD)を計算します。
    2. RTで0、2、4、6、8、12、および24時間保存された同じサンプル溶液を分析してサンプル溶液の安定性を評価し、ステップ1.3.5の説明に従って相対保持時間と相対ピーク面積のRSDを計算します。
    3. 同じサンプル(CMT-4)の6回の反復を取り、上記の手順に従ってサンプル溶液を調製し(ステップ1.2)、ステップ1.1に続いてHPLCでその指紋を検出します。相対保持時間と相対ピーク面積のRSDを計算し、ステップ1.3.5の説明に従ってその再現性を評価します。
    4. 次に、 図1B のピーク数10を基準ピークとして使用し、ステップ1.3.5で説明したように、各共通ピークの相対保持時間と相対ピーク面積のRSDを計算します。
    5. 以下の式を使用して、各共通ピークの相対保持時間と相対ピーク面積を計算します。
      T re = T 特性/T参考
      A re = A 特性/Aリファレンス
      ここで、T re = 相対保持時間、T 特性 = 特性ピーク保持時間、T 基準 = 基準ピーク保持時間、A re = 相対ピーク面積、A 特性 = 特性ピーク面積、および A 基準 = 基準ピーク面積。
      注:伝統的な漢方薬の指紋を確立するには、通常、取得が容易で高分解能のクロマトグラフィーピークを選択する必要があります。これは、指紋を識別し、その安定性と再現性を調べるための基準ピークとして使用されます。

2.チュアンムートンの指紋と類似性分析の確立

  1. 本物のサンプルの10バッチと、 クレマチス・アルゼンティルシア (Levl. et Vant.) W. T. Wang(CC)、 Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehdなどの偽和物の5バッチを使用してください。エトウィルズ。(DC)、 クレマチスペテラエ ハンド。(DE)、 クレマチス・グリアナ・ ロクスブ。Var. finetii Rehd.et Wils (XS)、および Clematis finetiana Levl.et Vaniot.(SMT)を指紋分析用のサンプルとして使用します。
  2. 手順 1.2 の説明に従ってサンプル溶液を調製します。ステップ1.1に記載されている条件に従って、HPLCによるすべてのサンプル溶液の指紋分析を実行します。
  3. 関連データを漢方薬のクロマトグラフィー指紋の類似性評価システムにインポートします(SESCF-TCM、2012年版)。システムは、すべてのサンプルのクロマトグラムで妥当な高さと良好な分解能を持つピークを共通のピークとして指定します。
    注:SESCF-TCMソフトウェアは、中国薬局方委員会(http://114.247.108.158:8888/login)のウェブサイトで登録後にダウンロードできます。
    1. ソフトウェアで、メニューの [参照スペクトルの設定 ]ボタンをクリックします。
    2. 次に、[パラメータ設定] ウィンドウで、[タイム ウィンドウ幅] を 0.5 に設定し、[中央値手法] として [スペクトル生成方法を制御] を選択します。
    3. メインメニューの[マルチポイントキャリブレーション]をクリックし、[フルスペクトルピークマッチング]として[ピークマッチング]を選択します。
    4. 最後に、[ コントロールの生成 ]をクリックして、チュアンムトンの本物の種の参照クロマトグラフィーフィンガープリントを生成します。
  4. 分析のために、本物のチュアンムトンサンプル10バッチと不純物混入物5バッチの保持時間とピーク面積をSESCF-TCMにインポートします。具体的な操作は次のとおりです。
    1. ソフトウェアで、メインメニューの[ 基準スペクトルの設定 ]ボタンをクリックします。
    2. [パラメータ設定]ウィンドウで、チュアンムトンの本物の種の参照クロマトグラフィーフィンガープリントを基準として設定し、[中央値法]として[制御スペクトル生成方法]を選択し、[タイムウィンドウ幅]を0.5に設定します。
    3. メインメニューの[マルチポイントキャリブレーション]をクリックし、[フルスペクトルピークマッチング]として[ピークマッチング]を選択します。
    4. 最後に、[ 類似度の計算 ]をクリックして、Chuanmutongの参照クロマトグラムフィンガープリントに基づいて類似度を計算します。最後に、漢方薬クロマトグラフィー指紋評価システム(2012年版)を使用して指紋の類似性を計算します。
      注意: 特定の操作については、漢方薬クロマトグラフィー指紋評価システム(2012年版)の動作仕様を参照してください。

3. チュアンムトン指紋のマルチパターン認識解析

  1. クラスター分析 (CA)
    1. 本物のChuanmutongサンプルの10バッチとその5バッチの偽和物のフィンガープリントの12の一般的なピークのピーク領域を変数として使用し、それらを統計分析ソフトウェアに入力して体系的なクラスター分析(CA)を行います。
    2. グループ間法を選択し、ピアソン相関係数を分類基準として使用して、チュアンムトンとその不純物のクラスター分析図を作成します。具体的な操作は次のとおりです。
      1. 統計分析ソフトウェアで、[ファイル]をクリックしてデータをインポートします。
      2. メニューの[分析]をクリックし、[分類]の[システムクラスタリング]をクリックします。
      3. 共通ピーク面積を変数として選択し、クラスター数を4に設定します。
      4. [方法]をクリックし、[クラスタリング 方法]を [グループ間接続]として選択し、[測定間隔]を [ピアソン相関]として選択し、[ OK ]をクリックしてCAマップを描画します。
  2. 主成分分析(PCA)
    1. 本物の品種とその混入物の相対的な共通ピーク面積をPCA分析用の分析ソフトウェアにインポートし、PCAスコアマップを使用してサンプル差のスコアマトリックスマップを評価します。具体的な操作は次のとおりです。
      1. データ分析ソフトウェアを開き、メニューの[ ファイル ]をクリックして、新しい通常のプロジェクトを作成します。HPLCシステムからスプレッドシート(Excel形式など)で12の一般的なピークのピーク面積をインポートします。次に、[ 完了] をクリックしてデータのインポートを完了します。
      2. [ 新規 ] をクリックして新しいモデルを作成し、PCA でモデル タイプを設定します。[ 自動調整 ]と [追加 ]をクリックしてデータを合わせ、[スコア]をクリックしてPCA スコア マップを取得します。
  3. 直交偏最小二乗判別分析 (OPLS-DA)
    1. 監督モードを使用した直交部分最小二乗識別分析法を使用して、本物のチュアンムトン品種と混入物の相対的な共通ピーク面積ピークをさらに分析し、すべてのサンプルのOPLS-DA分類スコアマップを作成します。具体的な操作は次のとおりです。
      1. データ解析ソフトで、メニューの「 ファイル 」をクリックしてファイルをインポートし、新しいレギュラープロジェクトを作成します。HPLCシステムからスプレッドシートに12の一般的なピークのピーク面積をインポートし、 完了 をクリックしてデータのインポートを完了します。
      2. [ 新規 ] をクリックして新しいモデルを作成し、PCA でモデル タイプを設定します。[ 自動調整 ] と [追加 ] をクリックして、データを合わせます。次に、[スコア ] をクリックしてPCAスコアマップを取得します。
      3. 新規をクリックし、モデル1として新規を選択して、OPLS-DAでモデルタイプを設定します。
      4. [スケール]をクリックし、タイプを[すべてにパー]で設定します。最初に[自動調整]をクリックし、次に[スコア]をクリックしてOPLS-DAスコアマップを取得します。
    2. チュアンムトンの各共通ピークが分類結果に与える影響、および本物のチュアンムトン材料と関連する不純物の違いを判断するには、分析に投影法(VIP)の変数重要度を使用します。
    3. チュアンムートンのさまざまなコンポーネントのVIPマップを描きます。結果のVIPマップを使用して、分類に対する各変数の影響を評価し、グループ間の差に大きく寄与するコンポーネントを選別します。具体的な操作は次のとおりです。
      1. データ分析ソフトウェアで、メニューの[分析]をクリックし、[順列]をクリックし、順列の数を200に設定して、OPLS-DAスコアマップのR2とQ2を取得します。
      2. [VIP] をクリックし、[VIP 予測] を選択して VIP マップを取得します。

4.HPLCによるチュアンムートン中のβ-シトステロールの測定

  1. クロマトグラフィー条件(ステップ1.1を参照)
    1. 移動相を準備します:メタノール-水(97:3)。
    2. 移動相の流量を1.0 mL/minに設定します。
    3. 30°Cに維持したC18カラム(250 mm x 4.6 mm、5 μm)でクロマトグラフィー分離を行います。
    4. 注入量を10μLに設定します。
    5. 波長204nmの成分を検出します。
  2. 試料溶液の調製
    1. β-シトステロール(0.1 mg/mL)の標準液は、対応する標準物質の正確な計量量をメタノールに溶解して調製します。
    2. 原料の分析試料を内径180μm±7.6μmのナイロンメッシュに通して均一な粒径に粉砕する。
    3. 粉砕した原料2 g(正確に秤量)を丸底フラスコに入れ、それに50 mLのクロロホルムを加える。
    4. フラスコを還流冷却器に接続し、沸騰水浴(中程度の沸騰)で60分間加熱します。抽出溶液を15〜20μmのろ紙でろ過します。
    5. ろ液を沸騰水浴(中程度の沸騰)で約10分間ほぼ乾くまで蒸発させます。
    6. 残渣を溶解し、メタノールを使用して容量を5 mLに構成します。最後に、上清を0.45μmのフィルター膜に通し、スタンバイ状態にします。
  3. メソッドバリデーション
    1. サブステップ4.2.1で調製したβ-シトステロールのストック溶液を取り、100%メタノールで希釈し、100 μg/mL、80 μg/mL、60 μg/mL、50 μg/mL、40 μg/mL、30 μg/mL、および20 μg/mLの濃度の溶液を調製します。
    2. ステップ4.1に記載のクロマトグラフィー条件でサンプルを注入してピーク面積を決定し、注入量に対するピーク面積で回帰分析を行い、回帰式と相関係数を取得してその直線性を評価します。
    3. 上記のようにサンプルを調製し(ステップ4.2)、同じ日に6回HPLC分析(ステップ4.1)に供します。次に、ピーク面積のRSDを計算して精度を評価します。
    4. ステップ4.1で説明したように、RTで0、2、4、6、8、12、および24時間保存された同じサンプル溶液を分析することにより、サンプル溶液の安定性を評価します。次に、ステップ1.3.5の説明に従ってピーク面積のRSDを計算します。
    5. 同じサンプル(CMT-4)を六重剤に溶解し、ステップ4.2の説明に従って調製し、ステップ4.1の説明に従ってHPLC分析にかけることにより、再現性を調べます。次に、6つのサンプルのβ-シトステロール含有量のRSDを計算します。
    6. 標準的な加算方法を使用して、メソッドの精度を評価します。このためには、β-シトステロール含有量の80%、100%、および120%でβ-シトステロール参照溶液をサンプルに追加し、手順4.1で説明されているように各条件を3回繰り返します。平均回収率とRSDを計算して、メソッドの精度を評価します。
      注: 回復率 (RR) の計算式は次のとおりです。
      RR % = [(M t - M 0) / Ms] × 100
      ここで、Mt=標準物質を添加した後のβ−シトステロールの品質、M0=試料溶液の品質、およびMs=添加したβ−シトステロールの品質。
  4. サンプルのβ-シトステロール含有量の測定
    1. 本物の漢方薬材料10バッチと関連する不純物の5バッチを取り、ステップ4.2に従ってサンプル溶液を調製します。
    2. 次に、各試料溶液およびβ−シトステロール参照溶液を注入して、ステップ4.1に記載の条件下でピーク面積を決定し、外部標準ワンポイント法を用いて各試料のβ−シトステロール含有量を算出する。

結果

チュアンムートンのクロマトグラフィーフィンガープリントと類似性分析(SA)
精度、再現性、安定性の相対保持時間のRSD値は、それぞれ0.46%、1.65%、0.53%未満でした。相対ピーク面積のRSD値は、それぞれ4.23%、3.56%、3.96%未満でした。 図1A、Bに示すように、10個の本物のチュアンムトンサンプルのHPLCフィンガープリントには、12個の異なる共通ピ?...

ディスカッション

研究用のサンプルコレクションは、漢方薬の真正性を特定する際のマルチパターン認識を構築するための最初の重要なステップです。市場調査を通じて、四川亜安、梁山、楽山が川和通の野生資源の主な生産地であることがわかりました。同じ属の関連品種も同じ地理的分布を持っています6,20;CC、DC、DE、XS、およびSMTは、チュアンムトン

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、四川省中医薬管理局のプロジェクト(番号2020JC0088、番号2021MS203)によってサポートされました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidZhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China2017381038
AcetonitrileSigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, ChinaWXBD5243V
β-SitosterolMeisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China20210201
 C18 columnYuexu Material Technology Co., Ltd., Shanghai, ChinaWelch Ultimate LP
ChuanmutongGuoqiang Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China 19020103CMT-1
ChuanmutongHongya Wawushan Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 200701CMT-2
ChuanmutongHongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 200701CMT-3
ChuanmutongHongpu Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 200901CMT-4
ChuanmutongXinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 210701CMT-5
ChuanmutongHaobo Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 210401CMT-6
ChuanmutongXinrentai Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China 200901CMT-7
ChuanmutongWusheng Pharmaceutical Group Co., Ltd., Sichuan, China 201201CMT-8
ChuanmutongLimin Chinese Herbal Pieces Co., Ltd., Sichuan, China 201001CMT-9
ChuanmutongYuhetang Pharmaceutical Co., Ltd., Sichuan, China210501CMT-10
Clematis argentilucida (Levl. et Vant.) W. T. WangMadzi Bridge, Sanlang Township, Tianquan County, Sichuan, China -CC
Clematis apiifolia var. obtusidentata Rehd. et Wils.Heilin Village, Qiliping Township, Hongya County, Sichuan, China -DC
Clematis peterae Hand.-Mazz.Huangmu Village, Huangmu Township, Hanyuan County, Sichuan, China -DE
Clematis gouriana Roxb. Var. finetii Rehd. et WilsMixedang Mountain, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China -XS
Clematis finetiana Levl. et Vaniot.Wannian Village, Huangwan Township, Emei County, Sichuan, China -SMT
Electronic balanceHaozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai,  China FA1204
ErgosterolMeisai Biological Technology Co., Ltd, Chongqing, China20210201
EthanolKelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China2021112602
Ethyl acetateZhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China2017042043
Formic acidKelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China2016062901
High performance liquid chromatographyAgilent, USA.1260
IBM SPSS Statistics version 26.0International Business Machines Corporation, USA-
MethanolSigma-Aldrich  Trading Co., Ltd., Shanghai, ChinaWXBD6409V
MethanolKelon Chemical Co., Ltd., Chengdu, China202010302
n-butyl alcoholZhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China2020071047
Petroleum etherZhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China2020090125
Phosphoric acidComeo Chemical Reagent Co., Ltd., Tianjin, China20200110
SESCF-TCM version 2012National Pharmacopoeia Commission, China-http://114.247.108.158:8888/login
StigmasterolMeisai Biological Technology Co., Ltd., Chongqing, China20210201
TrichloromethaneSinopharm Group Chemical Reagent Co., Ltd., Shanghai, China20200214
Umetrics SIMCA version 14.1.0.2047Umetrics, Sweden-https://www.sartorius.com/en/products/process-analytical-technology/data-analytics-software/mvda-software/simca/simca-free-trial-download
Ultrapure water machineYoupu Ultrapure Technology Co., Ltd., Sichuan, ChinaUPH-II-10T
Ultrasonic cleanerKunshan Hechuang Ultrasound Instrument Co., Ltd., Jiangsu, ChinaKH3200E

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