Montagem de lipossomas assistida por octanol on-chip para bioengenharia

O presente protocolo descreve a montagem de lipossomas assistida por octanol (OLA), uma técnica microfluídica para gerar lipossomas biocompatíveis. O OLA produz lipossomas monodispersos do tamanho de mícrons com encapsulamento eficiente, permitindo a experimentação imediata no chip. Prevê-se que este protocolo seja particularmente adequado para biologia sintética e pesquisa de células sintéticas.

A microfluídica é uma ferramenta amplamente utilizada para gerar gotículas e vesículas de vários tipos de forma controlada e de alto rendimento. Os lipossomas são miméticos celulares simplistas compostos por um interior aquoso circundado por uma bicamada lipídica; Eles são valiosos para projetar células sintéticas e entender os fundamentos das células biológicas de forma in vitro e são importantes para ciências aplicadas, como a entrega de carga para aplicações terapêuticas. Este artigo descreve um protocolo de trabalho detalhado para uma técnica microfluídica on-chip, montagem de lipossomas assistida por octanol (OLA), para produzir lipossomas biocompatíveis monodispersos, de tamanho micron. O OLA funciona de forma semelhante ao sopro de bolhas, onde uma fase aquosa interna (IA) e uma fase adjacente de 1-octanol carreadora de lipídios são pinçadas por fluxos de fluido externo contendo surfactante. Isso gera prontamente gotículas de emulsão dupla com bolsas de octanol salientes. À medida que a bicamada lipídica se reúne na interface da gota, a bolsa se desprende espontaneamente para dar origem a um lipossomo unilamelar que está pronto para posterior manipulação e experimentação. O OLA oferece várias vantagens, como geração constante de lipossomas (>10 Hz), encapsulamento eficiente de biomateriais e populações de lipossomas monodispersas, e requer volumes de amostra muito pequenos (~50 μL), o que pode ser crucial quando se trabalha com biológicos preciosos. O estudo inclui detalhes sobre microfabricação, litografia suave e passivação de superfície, que são necessários para estabelecer a tecnologia OLA no laboratório. Uma aplicação da biologia sintética de prova de princípio também é mostrada induzindo a formação de condensados biomoleculares dentro dos lipossomas via fluxo de prótons transmembrana. Espera-se que este protocolo de vídeo que o acompanha facilitará aos leitores estabelecer e solucionar problemas de OLA em seus laboratórios.

Todas as células têm uma membrana plasmática como limite físico, e esta membrana é essencialmente um arcabouço na forma de uma bicamada lipídica formada pela auto-montagem de moléculas lipídicas anfifílicas. Os lipossomas são as contrapartes sintéticas mínimas das células biológicas; Possuem lúmen aquoso circundado por fosfolipídios, que formam uma bicamada lipídica com os grupos de cabeças hidrofílicas voltadas para a fase aquosa e as caudas hidrofóbicas enterradas para dentro. A estabilidade dos lipossomas é governada pelo efeito hidrofóbico, assim como pela hidrofilicidade entre os grupos polares, forças de van der Waals entre as caudas de carbono hidrofóbicas e a ....

1. Fabricação do wafer mestre

1. Pegue um wafer de silicone limpo de 4 polegadas (10 cm) de diâmetro (consulte a Tabela de Materiais). Limpe-o ainda mais usando ar pressurizado para remover quaisquer partículas de poeira.
2. Monte o wafer em um revestidor de spin e distribua suavemente ~5 mL de um fotorresiste negativo (consulte a Tabela de Materiais) no centro do wafer. Tente evitar bolhas de ar, pois elas podem interferir no processo de impressão a j.......

Este estudo demonstra a formação de condensados sem membrana através do processo de separação de fase líquido-líquido (LLPS) dentro de lipossomas como um experimento representativo.

Preparo da amostra
O IA, OA, ES e a solução de alimentação (FS) são preparados da seguinte forma:

IA: glicerol a 12%, dextrana 5 mM, KCl 150 mM, poli-L-lisina (PLL) a 5 mg/mL, poli-L-lisina-FITC marcada com 0,05 mg/mL (PLL-FITC), trifosfato de ade.......

A complexidade celular torna extremamente difícil entender as células vivas quando estudadas como um todo. Reduzir a redundância e a interconectividade das células por meio da reconstituição in vitro dos componentes-chave é necessário para aprofundar o entendimento dos sistemas biológicos e criar mímica celular artificial para aplicações biotecnológicas^22,23,24. Os lipossomas servem como um excelente sistema mínimo.......

Gostaríamos de agradecer a Dolf Weijers, Vera Gorelova e Mark Roosjen por gentilmente nos fornecerem YFP. S.D. reconhece o apoio financeiro do Conselho Holandês de Pesquisa (número da bolsa: OCENW. KLEIN.465).