JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Bioengineering

Biyomühendislik için On-Chip Oktanol Destekli Lipozom Montajı

Published: March 17th, 2023

DOI:

10.3791/65032

1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research
* These authors contributed equally

Mevcut protokol, biyouyumlu lipozomlar üretmek için mikroakışkan bir teknik olan oktanol yardımlı lipozom montajını (OLA) tanımlamaktadır. OLA, verimli kapsülleme ile monodispersed, mikron boyutunda lipozomlar üretir ve anında çip üzerinde deneylere izin verir. Bu protokolün sentetik biyoloji ve sentetik hücre araştırmaları için özellikle uygun olması beklenmektedir.

Mikroakışkanlar, kontrollü ve yüksek verimli bir şekilde çeşitli türlerde damlacıklar ve veziküller üretmek için yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Lipozomlar, bir lipit çift katmanı ile çevrili sulu bir iç kısımdan oluşan basit hücresel taklitlerdir; Sentetik hücrelerin tasarlanmasında ve biyolojik hücrelerin temellerinin in vitro bir şekilde anlaşılmasında değerlidirler ve terapötik uygulamalar için kargo teslimatı gibi uygulamalı bilimler için önemlidirler. Bu makalede, monodispersed, mikron boyutunda, biyouyumlu lipozomlar üretmek için çip üzerinde mikroakışkan bir teknik olan oktanol yardımlı lipozom montajı (OLA) için ayrıntılı bir çalışma protokolü açıklanmaktadır. OLA, bir iç sulu (IA) fazın ve çevreleyen lipit taşıyan 1-oktanol fazının, yüzey aktif madde içeren dış sıvı akışları tarafından sıkıştırıldığı kabarcık üflemeye benzer şekilde işlev görür. Bu kolayca çıkıntılı oktanol cepleri ile çift emülsiyon damlacıkları üretir. Lipid çift katmanlı damlacık arayüzünde bir araya geldiğinde, cep kendiliğinden ayrılarak daha fazla manipülasyon ve deney için hazır olan unilamellar bir lipozoma yol açar. OLA, sabit lipozom üretimi (>10 Hz), biyomalzemelerin verimli kapsüllenmesi ve monodisperse lipozom popülasyonları gibi çeşitli avantajlar sağlar ve değerli biyolojiklerle çalışırken çok önemli olabilecek çok küçük numune hacimleri (~ 50 μL) gerektirir. Çalışma, laboratuvarda OLA teknolojisini kurmak için gerekli olan mikrofabrikasyon, yumuşak litografi ve yüzey pasivasyonu ile ilgili ayrıntıları içermektedir. İlke kanıtı sentetik biyoloji uygulaması, transmembran proton akısı yoluyla lipozomların içinde biyomoleküler kondensatların oluşumunu indükleyerek de gösterilmiştir. Beraberindeki bu video protokolünün, okuyucuların laboratuvarlarında OLA kurmalarını ve sorunlarını gidermelerini kolaylaştıracağı tahmin edilmektedir.

Tüm hücrelerin fiziksel sınırları olarak bir plazma zarı vardır ve bu zar esasen amfifilik lipit moleküllerinin kendi kendine montajıyla oluşan bir lipit çift katmanı şeklinde bir iskeledir. Lipozomlar, biyolojik hücrelerin minimal sentetik karşılıklarıdır; Fosfolipitlerle çevrili sulu bir lümeni vardır, bu da sulu faza bakan hidrofilik kafa grupları ve içeriye gömülü hidrofobik kuyruklarla bir lipit çift katmanı oluşturur. Lipozomların stabilitesi, hidrofobik etkinin yanı sıra kutup grupları arasındaki hidrofilik, hidrofobik karbon kuyrukları arasındaki van der Waals kuvvetleri ve su molekülleri ile hidrofilik kafalar arasındaki hidrojen bağı tarafından yönetilir

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Ana gofret imalatı

  1. 4 inç (10 cm) çapında temiz silikon gofret alın (bkz. Toz parçacıklarını gidermek için basınçlı hava kullanarak daha fazla temizleyin.
  2. Gofreti bir spin kaplayıcı üzerine monte edin ve gofretin ortasına ~ 5 mL'lik negatif bir fotorezisti (bakınız Malzeme Tablosu) yavaşça dağıtın. Hava kabarcıklarından kaçınmaya çalışın, çünkü gofretin çıkış yönündeki baskı işlemine müdahale edebilirler.<.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bu çalışma, temsili bir deney olarak lipozomlar içinde sıvı-sıvı faz ayırma (LLPS) işlemi yoluyla membransız kondensatların oluşumunu göstermektedir.

Numune hazırlama
IA, OA, ES ve yem çözeltisi (FS) aşağıdaki gibi hazırlanır:

IA: %12 gliserol, 5 mM dekstran, 150 mM KCl, 5 mg/mL poli-L-lizin (PLL), 0,05 mg/mL poli-L-lizin-FITC etiketli (PLL-FITC), 8 mM adenozin trifosfat (ATP), 15 mM sitrat-HCl (pH 4)

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hücresel karmaşıklık, bir bütün olarak incelendiğinde canlı hücreleri anlamayı son derece zorlaştırır. Temel bileşenleri in vitro olarak yeniden yapılandırarak hücrelerin fazlalığını ve birbirine bağlanabilirliğini azaltmak, biyolojik sistemleri daha iyi anlamamız ve biyoteknolojik uygulamalar için yapay hücresel taklitler yaratmamız için gereklidir22,23,24. Lipozomlar, hücresel olayları anlamak iç.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dolf Weijers, Vera Gorelova ve Mark Roosjen'e bize YFP'yi nazik bir şekilde sağladıkları için teşekkür ederiz. S.D., Hollanda Araştırma Konseyi'nin mali desteğini kabul etmektedir (hibe numarası: OCENW. KLEIN.465).

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
1-OctanolSigma-AldrichNo. 297887
1.5 mL tubesFisher scientific10451043Eppendorf 3810X Polypropylene microcentrifuge tubes
ATPSigma-AldrichNo. A2383
Biopsy punchDarwin microfluidicsPT-T983-050.5 mm and 3 mm diameter
Citrate-baseSigma-AldrichNo. 71405
DextranSigma-AldrichNo. 31388Mr~6,000
Direct-write optical lithography machineDurham Magneto Optics LtdMicroWriter ML3 Babysetup and software
DOPC lipidAvantiSKU:850375C
F68Sigma-AldrichNo. 24040032
Glass cover slipCorning#1, 24 x 40 mm
GlycerolSigma-AldrichNo. G2025
Hydrochloric acidThermo Scientific AcrosNo. 124630010
Liss Rhod PE lipidAvantiSKU:810150C
ParafilmSigma-AldrichNo. P7793
PhotoresistMicro resist technology GmbHEpoCore 10
Photoresist developermicro resist technology GmbHmr-Dev 600
Plasma cleanerHarrick plasmaPDC-32G
PolydimethylsiloxaneDowSylgard 184PDMS and curing agent
Poly-L-lysineSigma-AldrichNo. P7890
Poly-L-lysine–FITC LabeledSigma-AldrichNo. P3543
Polyvinyl alcoholSigma-Aldrichno. P8136molecular weight 30,000–70,000, 87%–90% hydrolyzed
Pressure controllerElveflow OBK1 Mk3+Flow controller
Scotch tapeMagic Tape Invisible Matt Tape
Silicon waferSilicon Materials0620R16002
Spin coater Laurell Technologies CorporationModel WS-650MZ-23NPP
Stainless Steel 90° Bent PDMS CouplersDarwin microfluidicsPN-BEN-23G
Tris-baseSigma-AldrichNo. 252859
Tygon tubingDarwin microfluidics1/16" OD x 0.02" ID
UV laser 365 nm wavelength

  1. Frezard, F. Liposomes: From biophysics to the design of peptide vaccines. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 32 (2), 181-189 (1999).
  2. Monteiro, N., Martins, A., Reis, R. L., Neves, N. M. Liposomes in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of the Royal Society Interface. 11 (101), 20140459 (2014).
  3. Mishra, H., Chauhan, V., Kumar, K., Teotia, D. A comprehensive review on liposomes: A novel drug delivery system. Journal of Drug Delivery and Therapeutics. 8 (6), 400-404 (2018).
  4. Liu, W., et al. Research progress on liposomes: Application in food, digestion behavior and absorption mechanism. Trends in Food Science & Technology. 104, 177-189 (2020).
  5. Kamiya, K., Takeuchi, S. Giant liposome formation toward the synthesis of well-defined artificial cells. Journal of Materials Chemistry B. 5 (30), 5911-5923 (2017).
  6. van Swaay, D., DeMello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab on a Chip. 13 (5), 752-767 (2013).
  7. Lombardo, D., Kiselev, M. A. Methods of liposomes preparation: Formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application. Pharmaceutics. 14 (3), 543 (2022).
  8. Zhang, H., D’Souza, G. G. M. Thin-film hydration followed by extrusion method for liposome preparation. Liposomes: Methods and Protocols. , 17-22 (2017).
  9. Filipczak, N., Pan, J., Yalamarty, S. S. K., Torchilin, V. P. Recent advancements in liposome technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 156, 4-22 (2020).
  10. Has, C., Sunthar, P. A comprehensive review on recent preparation techniques of liposomes. Journal of Liposome Research. 30 (4), 336-365 (2020).
  11. Large, D. E., Abdelmessih, R. G., Fink, E. A., Auguste, D. T. Liposome composition in drug delivery design, synthesis, characterization, and clinical application. Advanced Drug Delivery Reviews. 176, 113851 (2021).
  12. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  13. Morita, M., et al. Droplet-shooting and size-filtration (DSSF) method for synthesis of cell-sized liposomes with controlled lipid compositions. ChemBioChem. 16 (14), 2029-2035 (2015).
  14. Convery, N., Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering. 2, 76-91 (2019).
  15. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  16. Chu, L. Y., Utada, A. S., Shah, R. K., Kim, J. W., Weitz, D. A. Controllable monodisperse multiple emulsions. Angewandte Chemie. 119 (47), 9128-9132 (2007).
  17. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. Engineering asymmetric vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (19), 10718-10721 (2003).
  18. Ota, S., Yoshizawa, S., Takeuchi, S. Microfluidic formation of monodisperse, cell-sized, and unilamellar vesicles. Angewandte Chemie International Edition. 48 (35), 6533-6537 (2009).
  19. Carugo, D., Bottaro, E., Owen, J., Stride, E., Nastruzzi, C. Liposome production by microfluidics: Potential and limiting factors. Scientific Reports. 6, 25876 (2016).
  20. Deshpande, S., Dekker, C. On-chip microfluidic production of cell-sized liposomes. Nature Protocols. 13 (5), 856-874 (2018).
  21. Last, M. G., Deshpande, S., Dekker, C. pH-controlled coacervate-membrane interactions within liposomes. ACS Nano. 14 (4), 4487-4498 (2020).
  22. Jia, H., Schwille, P. Bottom-up synthetic biology: reconstitution in space and time. Current Opinion in Biotechnology. 60, 179-187 (2019).
  23. Ganar, K. A., Leijten, L., Deshpande, S. Actinosomes: Condensate-Templated Containers for Engineering Synthetic Cells. ACE Synthetic Biology. 11 (8), 2869-2879 (2022).
  24. Gaut, N. T., Adamala, K. P. Reconstituting Natural Cell Elements in Synthetic Cells. Advanced Biology. 5 (3), 2000188 (2021).
  25. Ganar, K. A., Honaker, L. W., Deshpande, S. Shaping synthetic cells through cytoskeleton-condensate-membrane interactions. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 54, 101459 (2021).
  26. Bashirzadeh, Y., Liu, A. P. Encapsulation of the cytoskeleton: Towards mimicking the mechanics of a cell. Soft Matter. 15 (42), 8425-8436 (2019).
  27. Deshpande, S., et al. Spatiotemporal control of coacervate formation within liposomes. Nature Communications. 10, 1800 (2019).
  28. Love, C., et al. Reversible pH-responsive coacervate formation in lipid vesicles activates dormant enzymatic reactions. Angewandte Chemie. 132 (15), 6006-6013 (2020).
  29. Lu, T., et al. Endocytosis of coacervates into liposomes. Journal of the American Chemical Society. 144 (30), 13451-13455 (2022).
  30. Van de Cauter, L., et al. Optimized cDICE for efficient reconstitution of biological systems in giant unilamellar vesicles. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1690-1702 (2021).
  31. Blanken, D., Foschepoth, D., Serrão, A. C., Danelon, C. Genetically controlled membrane synthesis in liposomes. Nature Communications. 11, 4317 (2020).
  32. Bouzetos, E., Ganar, K. A., Mastrobattista, E., Deshpande, S., vander Oost, J. (R) evolution-on-a-chip. Trends in Biotechnology. 40 (1), 60-76 (2022).
  33. Kamalinia, G., Grindel, B. J., Takahashi, T. T., Millward, S. W., Roberts, R. W. Directing evolution of novel ligands by mRNA display. Chemical Society Reviews. 50 (16), 9055-9103 (2021).
  34. Godino, E., et al. De novo synthesized Min proteins drive oscillatory liposome deformation and regulate FtsA-FtsZ cytoskeletal patterns. Nature Communications. 10, 4969 (2019).
  35. Tenchov, R., Bird, R., Curtze, A. E., Zhou, Q. Lipid nanoparticles─From liposomes to mRNA vaccine delivery, a landscape of research diversity and advancement. ACS Nano. 15 (11), 16982-17015 (2021).
  36. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nature Communications. 7, 10447 (2016).
  37. Schaich, M., et al. An integrated microfluidic platform for quantifying drug permeation across biomimetic vesicle membranes. Molecular Pharmaceutics. 16 (6), 2494-2501 (2019).
  38. Schaich, M., Sobota, D., Sleath, H., Cama, J., Keyser, U. F. Characterization of lipid composition and diffusivity in OLA generated vesicles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1862 (9), 183359 (2020).
  39. Deshpande, S., Spoelstra, W. K., Van Doorn, M., Kerssemakers, J., Dekker, C. Mechanical division of cell-sized liposomes. ACS Nano. 12 (3), 2560-2568 (2018).
  40. Jusková, P., et al. 34;Basicles&#34;: Microbial growth and production monitoring in giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 11 (38), 34698-34706 (2019).
  41. Fletcher, M., et al. DNA-based optical quantification of ion transport across giant vesicles. ACS Nano. 16 (10), 17128-17138 (2022).
  42. Vaezi, Z., et al. Investigation of the programmed cell death by encapsulated cytoskeleton drug liposomes using a microfluidic platform. Microfluidics and Nanofluidics. 24 (7), 48 (2020).
  43. Al Nahas, K., et al. A microfluidic platform for the characterisation of membrane active antimicrobials. Lab on a Chip. 19 (5), 837-844 (2019).
  44. Bao, P., et al. Production of giant unilamellar vesicles and encapsulation of lyotropic nematic liquid crystals. Soft Matter. 17 (8), 2234-2241 (2021).
  45. Yandrapalli, N., Petit, J., Bäumchen, O., Robinson, T. Surfactant-free production of biomimetic giant unilamellar vesicles using PDMS-based microfluidics. Communications Chemistry. 4, 100 (2021).
  46. Cama, J., et al. An ultrasensitive microfluidic approach reveals correlations between the physico-chemical and biological activity of experimental peptide antibiotics. Scientific Reports. 12, 4005 (2022).
  47. Guerzoni, L. P., et al. High macromolecular crowding in liposomes from microfluidics. Advanced Science. 9 (27), 2201169 (2022).
  48. Gonzales, D. T., Yandrapalli, N., Robinson, T., Zechner, C., Tang, T. D. Cell-free gene expression dynamics in synthetic cell populations. ACS Synthetic Biology. 11 (1), 205-215 (2022).
  49. Ushiyama, R., Koiwai, K., Suzuki, H. Plug-and-play microfluidic production of monodisperse giant unilamellar vesicles using droplet transfer across water-oil interface. Sensors and Actuators B: Chemical. 355, 131281 (2022).
  50. Banlaki, I., Lehr, F. -. X., Niederholtmeyer, H., Karim, A. S., Jewett, M. C. Microfluidic production of porous polymer cell-mimics capable of gene expression. Cell-Free Gene Expression. , 237-255 (2022).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved