カテコールアミン作動性多形性心室頻拍の RyR2R2474S ノックインマウスの心臓の二重色素光学マッピング

Summary

このプロトコルは、高い時間的および空間的分解能の膜貫通電圧および細胞内Ca²⁺ トランジェントの電気生理学的測定を含む、カテコールアミン作動性多形心室頻拍の影響を受けた野生型およびノックイン動物から得られるマウス心臓の二重染料光学マッピングを導入します。

Abstract

不整脈誘発性心疾患であるカテコールアミン作動性多形性心室頻拍(CPVT)は、身体活動、ストレス、またはカテコールアミンチャレンジ後の多形性心室頻拍エピソードとして現れ、致命的な心室細動に悪化する可能性があります。マウスの心臓は、CPVTを含む遺伝性不整脈疾患のモデル化に広く用いられている種です。ランゲンドルフ灌流マウス心臓の膜貫通電位(_Vm)とカルシウム過渡現象(CaT)の同時光学マッピングは、不整脈発生のメカニズムを解明する可能性を秘めています。細胞レベルの調査と比較して、光学マッピング技術は、活性化、伝導速度、活動電位持続時間、CaT持続時間の決定など、いくつかの電気生理学的パラメータをテストできます。この論文では、マウス野生型およびヘテロ接合体RyR2-R2474S/+心臓におけるCaTおよびVmのハイスループット光学マッピングのための装置セットアップと実験手順を、イソプロテレノールチャレンジの前および最中にプログラムされた電気ペーシングと組み合わせて紹介します。このアプローチは、ex vivoマウスの心臓調製物におけるCPVT疾患を機構的に研究するための実行可能で信頼性の高い方法を実証しました。

Introduction

遺伝性心疾患カテコールアミン作動性多形性心室頻拍 (CPVT) は、身体活動、ストレス、またはカテコールアミンの挑戦に続く多形性心室頻拍 (PVT) エピソードとして現れ、致命的な心室細動に悪化する可能性があります 1,2,3,4 .1995年に臨床症候群として最初に報告された最近の証拠は、この状態での筋小胞体(SR)ストア^Ca2+放出に関与する7つの遺伝子の変異に関与しています:最も頻繁に報告されている^{Ca 2+}放出チャネル^5,6、FKBP12.6⁷、心臓カルセクエトリン⁸をコードするCASQ2、TRDNのリアノジン受容体2(RyR2)をコードするRYR2接合部SRタンパク質トリアジン⁹をコードし、CALM1 ⁹、CALM2 10、およびCALM3<....

Protocol

実験には、体重20〜25gの10〜14週齢の雄の野生型マウスまたはRyR2-R2474S/+マウス(C57BL/6バックグラウンド)を使用します。すべての手順は、中国四川省の西南医科大学の動物管理および使用委員会(承認番号:20160930)によって承認されており、機関が運営する国のガイドラインに準拠しています。

1. 事前準備

1. ストックソリューション
   1. ブレビスタチン原液:2.924 mgの(-)ブレビスタチン粉末を含む元のフラスコに100%ジメチルスルホキシド(DMSO)1 mLを加え、濃度を10 mMにします。
   2. 電圧指示器RH237原液:1 mLの100%DMSOを1 mgのRH237粉末とともに元のフラスコに加え、濃度を2.01 mMにします。
   3. カルシウムインジケーター Rhod-2 AM 原液:1 mL の 100% DMSO を 1 mg の Rhod-2 AM 粉末に添加し、濃度を 0.89 mM にします。
   4. Pluronic F127 原液:100% DMSO 1 mL を 200 mg の Pluronic F127 に添加し、濃度が 20% w/v(0.66 mM)になるようにします。
   5. ストック溶液を200 μLのPCRチューブに21〜51 μL(RH237 21 μL、Rhod-2 A....

Discussion

私たちの経験から、マウスの心臓の二重色素光学マッピングを成功させるための鍵は、十分に準備された溶液と心臓、色素のローディング、最高のS/N比の達成、およびモーションアーチファクトの低減です。

溶液の調製
クレブス溶液は、心臓実験を成功させるために不可欠です。MgCl 2 と CaCl₂ の原液 (1 mol/L) は、Mg 2+ と Ca2+ が CO₃

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm syringe filter	Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co., Ltd., Shanghai, China	N/A	To filter solution
15 mL centrifuge tube	Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China	CFT011150
1 mL Pasteur pipette	Beijing Labgic Technology Co., Ltd. China	00900026
1 mL Syringe	B. Braun Medical Inc.	YZB/GER-5474-2014
200 μL PCR tube	Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai. China	F611541-0010	Aliquote the stock solutions  to avoid repeated freezing and thawing
50 mL centrifuge tube	Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd. China	CFT011500	Store Tyrode's solution at 4 °C for follow-up heart isolation
585/40 nm filter	Chroma Technology	N/A	Filter for calcium signal
630 nm long-pass filter	Chroma Technology	G15604AJ	Filter for voltage signal
Avertin (2,2,2-tribromoethanol)	Sigma-Aldrich Poole, Dorset, United Kingdom	T48402-100G	To minimize suffering and pain reflex
Blebbistatin	Tocris Bioscience, Minneapolis, MN, United States	SLBV5564	Excitation-contraction uncoupler to  eliminate motion artifact during mapping
CaCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States	SLBK1794V	For Tyrode's solution
Custom-made thermostatic bath	MappingLab, United Kingdom	TBC-2.1	To keep temperature of perfusion solution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	(RNBT7442)	Solvent for dyes
Dumont forceps	Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China	YAF030
ElectroMap software	University of Birmingham	N/A	Quantification of electrical parameters
EMCCD camera	Evolve 512 Delta, Photometrics, Tucson, AZ, United States	A18G150001	Acquire images for optical signals
ET525/36 sputter coated filter	Chroma Technology	319106	Excitation filter
Glucose	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States	SLBT4811V	For Tyrode's solution
Heparin Sodium	Chengdu Haitong Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu, China	(H51021209)	To prevent blood clots in the coronary artery
Iris forceps	Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China	YAA010
Isoproterenol	MedChemExpress, Carlsbad, CA, United States	HY-B0468/CS-2582
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States	SLBS5003	For Tyrode's solution
MacroLED	Cairn Research, Faversham, United Kingdom	7355/7356	The excitation light of fluorescence probes
MacroLED light source	Cairn Research, Faversham, United Kingdom	7352	Control the LEDs
Mayo scissors	Medical equipment factory of Shanghai Medical Instruments Co.,Ltd.,Shanghai, China	YBC010
MetaMorph	Molecular Devices	N/A	Optical signals sampling
MgCl2	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States	BCBS6841V	For Tyrode's solution
MICRO3-1401	Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom	M5337	Connect the electrical stimulator and Spike2 software
MyoPacer EP field stimulator	Ion Optix Co, Milton, MA, United States	S006152	Electric stimulator
NaCl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States	SLBS2340V	For Tyrode's solution
NaH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States	BCBW9042	For Tyrode's solution
NaHCO3	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States	SLBX3605	For Tyrode's solution
NeuroLog System	Digitimer	NL905-229	For ECG amplifier
OmapScope5	MappingLab, United Kingdom	N/A	Calcium alternans and arrhythmia analysis
Ophthalmic scissors	Huaian Teshen Medical Instruments Co., Ltd., Jiang Su, China	T4-3904
OptoSplit	Cairn Research, Faversham, United Kingdom	6970	Split the emission light for detecting Ca2+ and Vm  simultaneously
Peristalic pump	Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,	BT100-2J	To pump the solution
Petri dish	BIOFIL	TCD010060
Pluronic F127	Invitrogen, Carlsbad, CA, United States	1899021	To enhance the loading with Rhod2AM
RH237	Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, United States	1971387	Voltage-sensitive dye
Rhod-2 AM	Invitrogen, Carlsbad, CA, United States	1890519	Calcium indicator
Silica gel tube	Longer Precision Pump Co., Ltd., Baoding, China,	96402-16	Connect with the peristaltic pump
Silk suture	Yuankang Medical Instrument Co., Ltd.,Yangzhou, China	20172650032	To fix the aorta
Spike2	Cambridge Electronic Design limited, United Kingdom	N/A	To record and analyze ECG data
Stimulation electrode	MappingLab, United Kingdom	SE1600-35-2020
T510lpxr	Chroma Technology	312461	For light source
T565lpxr	Chroma Technology	321343	For light source