芳香族氨基酸调控细胞代谢的生物正交化学成像

我们提出了一种协议，使用氧化氘（重水D₂O）探测的受激拉曼散射（DO-SRS）显微镜直接可视化由氨基酸调节的细胞中的代谢活动，该显微镜与双光子激发荧光显微镜（2PEF）集成。

必需芳香族氨基酸（AAA）是在细胞中合成新生物质和维持正常生物功能的基石。例如，充足的AAAs供应对于癌细胞维持其快速生长和分裂很重要。因此，对高度特异性、无创成像方法的需求不断增长，该方法具有最少的样品制备，以直接可视化细胞如何利用 AAA 进行 原位代谢。在这里，我们开发了一种光学成像平台，该平台将氧化氘（D₂O）探测与受激拉曼散射（DO-SRS）相结合，并将DO-SRS与双光子激发荧光（2PEF）集成到单个显微镜中，以直接可视化AAA调节下HeLa细胞的代谢活动。总的来说，DO-SRS平台为单个HeLa细胞单元中新合成的蛋白质和脂质提供了高空间分辨率和特异性。此外，2PEF模式可以无标记方式检测烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素的自发荧光信号。这里描述的成像系统与 体外 和 体内 模型兼容，对于各种实验都是灵活的。该协议的一般工作流程包括细胞培养、培养基制备、细胞同步、细胞固定以及使用 DO-SRS 和 2PEF 模式进行样品成像。

苯丙氨酸（Phe）和色氨酸（Tryp）是必需的芳香族氨基酸（AAA），可以被人体吸收，合成维持正常生物学功能的新分子¹。Phe是合成蛋白质，黑色素和酪氨酸所必需的，而Tryp是合成褪黑激素，血清素和烟酸^2,3所必需的。然而，过量食用这些AAA可以上调雷帕霉素（mTOR）途径的哺乳动物靶标，抑制AMP活化的蛋白激酶，并干扰线粒体代谢，共同改变大分子生物合成并导致恶性前体的产生，例如健康细胞中的活性氧（ROS）^4,5,6.在过量的AAA调节下直接可视化改变的代谢动力学对于了解AAA在促进癌症发展和健康细胞生长中的作用至关重要^7,8,9。

传统的AAA研究依赖于气相色谱（GC）¹⁰。其他方法，如磁共振成像（MRI），空间分辨率有限，因此难以对生物样品进行细胞和亚细胞分析

1. 培养基制备

1. 在含有 50% D₂O 的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM） 中制备 10 mL 对照和过量 AAA。
   1. 对于对照介质，在 15 mL 锥形管中测量 10 mg DMEM 粉末与 4.7 mL 双蒸水 （ddH₂O） 并混合。DMEM粉末含有标准浓度的所有氨基酸。彻底涡旋并倒置管，以确保溶液充分混合。加入 4.7 mL D₂O、0.5 mL 胎牛血清 （5% FBS） 和 0.1 mL 青霉素/链霉素 （1%）。彻底涡旋并倒置管，.......

将浓度为 15x 的过量 AAA 添加到含 50% D₂O 的细胞培养基中，在 HeLa 细胞中产生了新合成的脂质和蛋白质的不同 C-D 拉曼带（图 2B）。以前的实验是用不同的浓度水平进行的，例如2x和5x，虽然没有提供数据，但15x浓度产生了新合成的脂质和蛋白质的最明显的C-D拉曼带。具体来说，通过研究脂滴（LDs），我们注意到15x Phe和15x Tryp分别在2,143 cm-1和2,172 ^cm-1处诱导新合.......

DO-SRS和2PEF成像已被应用于研究各种离体模型中的代谢动力学，包括果蝇和人体组织21,22,23,24,26,27,33。本研究中使用的成像方式集成了DO-SRS和2PEF显微镜，无需使用细胞毒性试剂进行分子提取或标记，并且需要最少的样.......

我们感谢李亚娟博士和冯安东尼博士的技术支持，以及Fraley实验室的细胞系。我们感谢UCSD，NIH U54CA132378，NIH 5R01NS111039，NIH R21NS125395，NIHU54DK134301，NIHU54 HL165443和Hellman Fellow奖的启动资金。