Bioortogonal kemisk billeddannelse af cellemetabolisme reguleret af aromatiske aminosyrer

Vi præsenterer en protokol til direkte visualisering af metaboliske aktiviteter i celler reguleret af aminosyrer ved hjælp af deuteriumoxid (tungt vand D₂O) sondet stimuleret Raman-spredning (DO-SRS) mikroskopi, som er integreret med to-foton excitation fluorescens mikroskopi (2PEF).

Essentielle aromatiske aminosyrer (AAA'er) er byggesten til syntetisering af nye biomasser i celler og opretholdelse af normale biologiske funktioner. For eksempel er en rigelig forsyning af AAA'er vigtig for kræftceller for at opretholde deres hurtige vækst og deling. Med dette er der en stigende efterspørgsel efter en meget specifik, ikke-invasiv billeddannelsesmetode med minimal prøveforberedelse til direkte visualisering af, hvordan celler udnytter AAA'er til deres stofskifte in situ. Her udvikler vi en optisk billeddannelsesplatform, der kombinerer deuteriumoxid (D₂O) sondering med stimuleret Raman-spredning (DO-SRS) og integrerer DO-SRS med to-foton excitationsfluorescens (2PEF) i et enkelt mikroskop for direkte at visualisere HeLa-cellernes metaboliske aktiviteter under AAA-regulering. Samlet set giver DO-SRS-platformen høj rumlig opløsning og specificitet af nyligt syntetiserede proteiner og lipider i enkelte HeLa-celleenheder. Derudover kan 2PEF-modaliteten detektere autofluorescenssignaler af nicotinamid-adenin-dinukleotid (NADH) og Flavin på en etiketfri måde. Det billeddannelsessystem, der beskrives her, er kompatibelt med både in vitro- og in vivo-modeller , som er fleksibelt til forskellige forsøg. Den generelle arbejdsgang i denne protokol inkluderer cellekultur, tilberedning af kulturmedier, cellesynkronisering, cellefiksering og prøvebilleddannelse med DO-SRS- og 2PEF-modaliteter.

At være essentielle aromatiske aminosyrer (AAA'er), phenylalanin (Phe) og tryptophan (Tryp) kan absorberes af menneskekroppen for at syntetisere nye molekyler til opretholdelse af normale biologiske funktioner¹. Phe er nødvendig til syntese af proteiner, melanin og tyrosin, mens Tryp er nødvendig til syntese af melatonin, serotonin og niacin ^2,3. Imidlertid kan overskydende forbrug af disse AAA'er opregulere pattedyrets mål for rapamycin (mTOR) -vejen, hæmme AMP-aktiveret proteinkinase og forstyrre mitokondriemetabolismen, kollektivt ændre makromolekylebiosyntese og føre til produktion ....

1. Forberedelse af medier

1. Forbered 10 ml kontrol og overskydende AAA'er i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 50% D₂O.
   1. Til kontrolmediet måles og blandes 10 mg DMEM-pulver med 4,7 ml dobbeltdestilleret vand (ddH₂O) i et 15 ml konisk rør. DMEM-pulveret indeholder alle aminosyrerne i standardkoncentrationer. Grundigt hvirvel og vend røret for at sikre, at opløsningen er godt blandet. Tilsæt 4,7 ml D₂O, 0,5 ml føtalt bovint serum (5.......

Tilsætningen af overskydende AAA'er ved 15x koncentrationer til de 50% D₂O-holdige cellekulturmedier producerede forskellige C-D Raman-bånd af nyligt syntetiserede lipider og proteiner i HeLa-celler (figur 2B). Tidligere eksperimenter blev udført med forskellige koncentrationsniveauer, såsom 2x og 5x, og selvom dataene ikke præsenteres, producerede 15x-koncentrationen de mest tydelige C-D Raman-bånd af nyligt syntetiserede lipider og proteiner. Specifikt ved at undersøge li.......

DO-SRS og 2PEF billeddannelse er blevet anvendt til at undersøge metabolisk dynamik i forskellige ex vivo modeller, herunder Drosophila og humane væv 21,22,23,24,26,27,33. Den billeddannelsesmodalitet, der anvendes i denne undersøgelse, integrerer DO-SRS og 2PEF-mikroskopi, som k.......

Vi takker Dr. Yajuan Li og Anthony Fung for deres tekniske support og Fraley-laboratoriet for cellelinjen. Vi anerkender opstartsmidlerne fra UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 og Hellman Fellow Award.