Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Bioengineering
Wir stellen ein Protokoll vor, um metabolische Aktivitäten in Zellen, die durch Aminosäuren reguliert werden, direkt sichtbar zu machen, indem wir Deuteriumoxid (schweres Wasser D2O) mit sondierter stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) verwenden, die in die Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie (2PEF) integriert ist.
Essentielle aromatische Aminosäuren (AAAs) sind Bausteine für die Synthese neuer Biomassen in Zellen und die Aufrechterhaltung normaler biologischer Funktionen. Zum Beispiel ist ein reichliches Angebot an AAAs für Krebszellen wichtig, um ihr schnelles Wachstum und ihre Teilung aufrechtzuerhalten. Damit steigt die Nachfrage nach einem hochspezifischen, nicht-invasiven Bildgebungsansatz mit minimaler Probenvorbereitung, um direkt zu visualisieren, wie Zellen AAAs für ihren Stoffwechsel in situ nutzen. Hier entwickeln wir eine optische Bildgebungsplattform, die Deuteriumoxid (D2O)-Sondierung mit stimulierter Raman-Streuung (DO-SRS) kombiniert und DO-SRS mit Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenz (2PEF) in ein einziges Mikroskop integriert, um die Stoffwechselaktivitäten von HeLa-Zellen unter AAA-Regulierung direkt sichtbar zu machen. Insgesamt bietet die DO-SRS-Plattform eine hohe räumliche Auflösung und Spezifität von neu synthetisierten Proteinen und Lipiden in einzelnen HeLa-Zelleinheiten. Darüber hinaus kann die 2PEF-Modalität Autofluoreszenzsignale von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NADH) und Flavin markierungsfrei detektieren. Das hier beschriebene Bildgebungssystem ist sowohl mit In-vitro- als auch mit In-vivo-Modellen kompatibel, was für verschiedene Experimente flexibel ist. Der allgemeine Arbeitsablauf dieses Protokolls umfasst Zellkultur, Nährmedienvorbereitung, Zellsynchronisation, Zellfixierung und Probenbildgebung mit DO-SRS- und 2PEF-Modalitäten.
Als essentielle aromatische Aminosäuren (AAAs) können Phenylalanin (Phe) und Tryptophan (Tryp) vom menschlichen Körper aufgenommen werden, um neue Moleküle zur Aufrechterhaltung normaler biologischer Funktionen zu synthetisieren1. Phe wird für die Synthese von Proteinen, Melanin und Tyrosin benötigt, während Tryp für die Synthese von Melatonin, Serotonin und Niacinbenötigt wird 2,3. Ein übermäßiger Konsum dieser AAAs kann jedoch das Säugetierziel des Rapamycin-Signalwegs (mTOR) hochregulieren, die AMP-aktivierte Proteinkinase hemmen und in den mitochondrialen Stoffwechsel eingreifen, wo....
1. Medienaufbereitung
Die Zugabe von überschüssigen AAAs in 15-facher Konzentration zu den 50%D2O-haltigenZellkulturmedien führte zu deutlichen C-D-Raman-Banden neu synthetisierter Lipide und Proteine in HeLa-Zellen (Abbildung 2B). Frühere Experimente wurden mit unterschiedlichen Konzentrationsniveaus durchgeführt, z. B. 2x und 5x, und obwohl die Daten nicht präsentiert werden, erzeugte die 15-fache Konzentration die deutlichsten C-D-Raman-Banden neu synthetisierter Lipide und Proteine. Insbesond.......
DO-SRS- und 2PEF-Bildgebung wurden eingesetzt, um die Stoffwechseldynamik in verschiedenen Ex-vivo-Modellen zu untersuchen, darunter Drosophila und menschliches Gewebe 21,22,23,24,26,27,33. Die in dieser Studie verwendete Bildgebungsmodalität integriert DO-SRS und 2PEF-Mikroskopie,.......
Wir danken Dr. Yajuan Li und Anthony Fung für ihre technische Unterstützung und dem Fraley-Labor für die Zelllinie. Wir bedanken uns für die Anschubfinanzierung von UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 und Hellman Fellow Award.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 - 1100 nm |
Centrifuge | |||
Condenser | Olympus | ||
Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
DC power supply | TopWard | 6302D | |
Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25x36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer - Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
Penicillin/Streptomycin | Thermofischer - Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
Silicon Wafer | |||
Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
Tweezers | Kaverme - Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |
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