芳香族アミノ酸によって制御される細胞代謝のバイオ直交化学イメージング

2光子励起蛍光顕微鏡(2PEF)と統合された酸化重水素(重水D₂O)プローブ誘導ラマン散乱(DO-SRS)顕微鏡を使用して、アミノ酸によって制御される細胞の代謝活動を直接視覚化するプロトコルを提示します。

必須芳香族アミノ酸(AAA)は、細胞内で新しいバイオマスを合成し、正常な生物学的機能を維持するための構成要素です。例えば、AAAの豊富な供給は、癌細胞が急速な成長と分裂を維持するために重要です。これに伴い、細胞がその 場での代謝のためにAAAをどのように利用しているかを直接視覚化するために、最小限のサンプル調製で高度に特異的で非侵襲的なイメージングアプローチに対する需要が高まっています。ここでは、酸化重水素(_D2O)プロービングと誘導ラマン散乱(DO-SRS)を組み合わせた光学イメージングプラットフォームを開発し、DO-SRSと2光子励起蛍光(2PEF)を1つの顕微鏡に統合して、AAA制御下でのHeLa細胞の代謝活動を直接可視化します。DO-SRSプラットフォームは、単一のHeLa細胞ユニットで新たに合成されたタンパク質と脂質の高い空間分解能と特異性を提供します。さらに、2PEFモダリティは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)およびフラビンの自己蛍光シグナルをラベルフリーで検出できます。ここで説明するイメージングシステムは、in vitro モデルと in vivo モデルの両方に対応しており、さまざまな実験に柔軟に対応します。このプロトコルの一般的なワークフローには、細胞培養、培地調製、細胞同期、細胞固定、およびDO-SRSおよび2PEFモダリティによるサンプルイメージングが含まれます。

必須の芳香族アミノ酸(AAA)であるフェニルアラニン(Phe)とトリプトファン(Tryp)は、人体に吸収されて、正常な生物学的機能を維持するための新しい分子を合成することができます¹。Pheはタンパク質、メラニン、チロシンの合成に必要であり、Trypはメラトニン、セロトニン、ナイアシンの合成に必要です^2,3。しかし、これらのAAAの過剰摂取は、ラパマイシン(mTOR)経路の哺乳類標的をアップレギュレートし、AMP活性化プロテインキナーゼを阻害し、ミトコンドリア代謝を妨害し、高分子生合成を集合的に変化させ、健康な細胞における活性酸素種(ROS)などの悪性前駆体の産生につながる可能性があります^4,5,6.過剰なAAA調節下での変化した代謝動態の直接的な可視化は、がんの発生と健康な細胞の成長を促進するAAAの役割を理解するために不可欠です^7,8,9。

1. 培地調製

1. 50%_D2Oを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10mLのコントロールおよび過剰のAAAを調製する。
   1. コントロール培地については、15 mLのコニカルチューブで10 mgのDMEM粉末を4.7 mLの二重蒸留水(_ddH2O)と測定して混合します。DMEM粉末には、標準濃度のすべてのアミノ酸が含まれています。チューブを完全にボルテックスして反転させ、溶液がよく?.......

50%_D2O含有細胞培養培地に15倍の濃度で過剰のAAAを添加すると、HeLa細胞において新たに合成された脂質およびタンパク質の明確なC-Dラマンバンドが生じた(図2B)。以前の実験は、2倍や5倍などの異なる濃度レベルで行われ、データは提示されていませんが、15倍の濃度は、新しく合成された脂質とタンパク質の最も明確なC-Dラマンバンドを生成しました。具体的には.......

DO-SRSおよび2PEFイメージングは、ショウジョウバエおよびヒト組織を含む様々なex vivoモデルにおける代謝動態を調べるために適用されている21,22,23,24,26,27,33。この研究で使用されたイメージングモダリティは、DO-.......

技術サポートを提供してくださったYajuan Li博士とAnthony Fung博士、そして細胞株を提供してくれたFraleyラボに感謝します。UCSD、NIH U54CA132378、NIH 5R01NS111039、NIH R21NS125395、NIHU54DK134301、NIHU54 HL165443、ヘルマンフェロー賞からのスタートアップ資金に感謝します。