Imagem Química Bioortogonal do Metabolismo Celular Regulado por Aminoácidos Aromáticos

Apresentamos um protocolo para visualizar diretamente as atividades metabólicas em células reguladas por aminoácidos usando microscopia Raman estimulada de espalhamento Raman estimulado com óxido de deutério (água pesada D₂O) (DO-SRS), que é integrada à microscopia de fluorescência por excitação de dois fótons (2PEF).

Aminoácidos aromáticos essenciais (AAAs) são blocos de construção para sintetizar novas biomassas em células e sustentar funções biológicas normais. Por exemplo, um suprimento abundante de AAAs é importante para que as células cancerosas mantenham seu rápido crescimento e divisão. Com isso, há uma demanda crescente por uma abordagem de imagem altamente específica, não invasiva, com preparação mínima da amostra para visualizar diretamente como as células aproveitam os AAAs para seu metabolismo in situ. Aqui, desenvolvemos uma plataforma de imagem óptica que combina sondagem de óxido de deutério (D₂O) com espalhamento Raman estimulado (DO-SRS) e integra DO-SRS com fluorescência de excitação de dois fótons (2PEF) em um único microscópio para visualizar diretamente as atividades metabólicas das células HeLa sob regulação AAA. Coletivamente, a plataforma DO-SRS fornece alta resolução espacial e especificidade de proteínas e lipídios recém-sintetizados em unidades únicas de células HeLa. Além disso, a modalidade 2PEF pode detectar sinais de autofluorescência de nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) e Flavina de forma livre de marcação. O sistema de imagem aqui descrito é compatível com modelos in vitro e in vivo , o que é flexível para vários experimentos. O fluxo de trabalho geral deste protocolo inclui cultura celular, preparação de meios de cultura, sincronização celular, fixação celular e imagem de amostra com as modalidades DO-SRS e 2PEF.

Sendo aminoácidos aromáticos essenciais (AAAs), fenilalanina (Phe) e triptofano (Tryp) podem ser absorvidos pelo organismo humano para sintetizar novas moléculas para sustentar funções biológicas normais¹. Phe é necessário para a síntese de proteínas, melanina e tirosina, enquanto Tryp é necessário para a síntese de melatonina, serotonina, e niacina ^2,3. No entanto, o consumo excessivo desses AAAs pode regular o alvo mamífero da via da rapamicina (mTOR), inibir a proteína quinase ativada por AMP e interferir no metabolismo mitocondrial, alterando coletivamente a biossíntese de macromolé....

1. Preparação da mídia

1. Preparar 10 mL de AAAs controle e excesso em meio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco contendo 50% D₂O.
   1. Para o meio controle, medir e misturar 10 mg de pó de DMEM com 4,7 mL de água bidestilada (ddH₂O) em um tubo cônico de 15 mL. O pó de DMEM contém todos os aminoácidos em concentrações padrão. Vórtice completamente e inverta o tubo para garantir que a solução esteja bem misturada. Adicionar 4,7 mL de D₂O, 0,5 mL de s.......

A adição do excesso de AAAs em concentrações de 15x aos meios de cultura celular contendo 50% D₂O produziu bandas Raman C-D distintas de lipídios e proteínas recém-sintetizados em células HeLa (Figura 2B). Experimentos anteriores foram realizados com diferentes níveis de concentração, como 2x e 5x, e embora os dados não sejam apresentados, a concentração de 15x produziu as mais distintas bandas Raman C-D de lipídios e proteínas recém-sintetizados. Especificamente,.......

DO-SRS e 2PEF têm sido aplicados para investigar a dinâmica metabólica em vários modelos ex vivo, incluindo Drosophila e tecidos humanos 21,22,23,24,26,27,33. A modalidade de imagem usada neste estudo integra a microscopia DO-SRS e 2PEF, que pode superar outros métodos de image.......

Agradecemos ao Dr. Yajuan Li e Anthony Fung por seu suporte técnico e ao laboratório Fraley pela linha celular. Agradecemos os fundos iniciais da UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 e Hellman Fellow Award.