Imagen química bioortogonal del metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos

Presentamos un protocolo para visualizar directamente las actividades metabólicas en células reguladas por aminoácidos utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada con sonda de óxido de deuterio (agua pesada D₂O) (DO-SRS), que se integra con microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones (2PEF).

Los aminoácidos aromáticos esenciales (AAA) son componentes básicos para sintetizar nuevas biomasas en las células y mantener las funciones biológicas normales. Por ejemplo, un suministro abundante de AAA es importante para que las células cancerosas mantengan su rápido crecimiento y división. Con esto, existe una creciente demanda de un enfoque de imagen altamente específico y no invasivo con una preparación mínima de la muestra para visualizar directamente cómo las células aprovechan los AAA para su metabolismo in situ. Aquí, desarrollamos una plataforma de imágenes ópticas que combina el sondeo de óxido de deuterio (D₂O) con la dispersión Raman estimulada (DO-SRS) e integra DO-SRS con fluorescencia de excitación de dos fotones (2PEF) en un solo microscopio para visualizar directamente las actividades metabólicas de las células HeLa bajo regulación AAA. En conjunto, la plataforma DO-SRS proporciona una alta resolución espacial y especificidad de proteínas y lípidos recién sintetizados en unidades celulares HeLa individuales. Además, la modalidad 2PEF puede detectar señales de autofluorescencia de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) y flavina de forma libre de marcas. El sistema de imágenes descrito aquí es compatible con modelos in vitro e in vivo , lo que es flexible para varios experimentos. El flujo de trabajo general de este protocolo incluye el cultivo celular, la preparación de los medios de cultivo, la sincronización celular, la fijación celular y la obtención de imágenes de muestras con las modalidades DO-SRS y 2PEF.

Al ser aminoácidos aromáticos esenciales (AAA), la fenilalanina (Phe) y el triptófano (Tryp) pueden ser absorbidos por el cuerpo humano para sintetizar nuevas moléculas para mantener las funciones biológicas normales¹. La Phe es necesaria para la síntesis de proteínas, melanina y tirosina, mientras que Tryp es necesaria para la síntesis de melatonina, serotonina y niacina ^2,3. Sin embargo, el consumo excesivo de estos AAA puede aumentar la diana de la vía de la rapamicina (mTOR) en los mamíferos, inhibir la proteína quinasa activada por AMP e interferir con el metabolismo mitocondrial, ....

1. Preparación de los medios

1. Prepare 10 mL de control y exceso de AAA en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene 50% de D₂O.
   1. Para el medio de control, mida y mezcle 10 mg de polvo de DMEM con 4,7 ml de agua bidestilada (ddH₂O) en un tubo cónico de 15 ml. El polvo de DMEM contiene todos los aminoácidos en concentraciones estándar. Realice un vórtice completo e invierta el tubo para asegurarse de que la solución esté bien mezclada. Añadir 4,7.......

La adición de un exceso de AAA a concentraciones de 15x a los medios de cultivo celular que contienen D₂O al 50% produjo distintas bandas C-D Raman de lípidos y proteínas recién sintetizados en células HeLa (Figura 2B). Los experimentos anteriores se realizaron con diferentes niveles de concentración, como 2x y 5x, y aunque no se presentan los datos, la concentración de 15x produjo las bandas C-D Raman más distintivas de lípidos y proteínas recién sintetizados. Específ.......

Las imágenes DO-SRS y 2PEF se han aplicado para investigar la dinámica metabólica en varios modelos ex vivo, incluyendo Drosophila y tejidos humanos 21,22,23,24,26,27,33. La modalidad de imagen utilizada en este estudio integra DO-SRS y microscopía 2PEF, que puede superar a otro.......

Agradecemos al Dr. Yajuan Li y Anthony Fung por su apoyo técnico, y al laboratorio Fraley por la línea celular. Agradecemos los fondos iniciales de UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 y Hellman Fellow Award.