Bioortogonal kemisk avbildning av cellmetabolism reglerad av aromatiska aminosyror

Vi presenterar ett protokoll för att direkt visualisera metaboliska aktiviteter i celler som regleras av aminosyror med hjälp av deuteriumoxid (tungt vatten D₂O) sonderad stimulerad Raman-spridning (DO-SRS) mikroskopi, som är integrerad med två-fotonexcitationsfluorescensmikroskopi (2PEF).

Essentiella aromatiska aminosyror (AAA) är byggstenar för att syntetisera ny biomassa i celler och upprätthålla normala biologiska funktioner. Till exempel är ett rikligt utbud av AAA viktigt för cancerceller att behålla sin snabba tillväxt och delning. Med detta finns det en ökande efterfrågan på en mycket specifik, icke-invasiv bildmetod med minimal provberedning för att direkt visualisera hur celler utnyttjar AAA för sin metabolism in situ. Här utvecklar vi en optisk avbildningsplattform som kombinerar deuteriumoxid (D₂O) sondering med stimulerad Raman-spridning (DO-SRS) och integrerar DO-SRS med tvåfotonexcitationsfluorescens (2PEF) i ett enda mikroskop för att direkt visualisera de metaboliska aktiviteterna hos HeLa-celler under AAA-reglering. Sammantaget ger DO-SRS-plattformen hög rumslig upplösning och specificitet av nyligen syntetiserade proteiner och lipider i enskilda HeLa-cellenheter. Dessutom kan 2PEF-modaliteten detektera autofluorescenssignaler av nikotinamidadenindinukleotid (NADH) och Flavin på ett etikettfritt sätt. Bildsystemet som beskrivs här är kompatibelt med både in vitro- och in vivo-modeller , vilket är flexibelt för olika experiment. Det allmänna arbetsflödet för detta protokoll inkluderar cellodling, förberedelse av odlingsmedia, cellsynkronisering, cellfixering och provavbildning med DO-SRS- och 2PEF-modaliteter.

Att vara essentiella aromatiska aminosyror (AAA), fenylalanin (Phe) och tryptofan (Tryp) kan absorberas av människokroppen för att syntetisera nya molekyler för att upprätthålla normala biologiska funktioner¹. Phe behövs för syntesen av proteiner, melanin och tyrosin, medan Tryp krävs för syntesen av melatonin, serotonin och niacin ^2,3. Överdriven konsumtion av dessa AAA kan dock uppreglera däggdjursmålet för rapamycinvägen (mTOR), hämma AMP-aktiverat proteinkinas och störa mitokondriell metabolism, kollektivt förändra makromolekylbiosyntesen och leda till produktion av maligna prekurso....

1. Förberedelse av media

1. Bered 10 ml kontroll och överskott av AAA i Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) innehållande 50% D₂O.
   1. För kontrollmediet, mät och blanda 10 mg DMEM-pulver med 4,7 ml dubbeldestillerat vatten (_ddH2O) i ett 15 ml koniskt rör. DMEM-pulvret innehåller alla aminosyror vid standardkoncentrationer. Virvla noggrant och vänd röret för att säkerställa att lösningen är väl blandad. Tillsätt 4,7 ml_D2O, 0,5 ml fetalt bovi.......

Tillsatsen av överskott av AAA vid 15x koncentrationer till 50% D₂O-innehållande cellodlingsmedia producerade distinkta C-D Raman-band av nyligen syntetiserade lipider och proteiner i HeLa-celler (figur 2B). Tidigare experiment utfördes med olika koncentrationsnivåer, såsom 2x och 5x, och även om data inte presenteras, producerade 15x-koncentrationen de mest distinkta C-D Raman-banden av nyligen syntetiserade lipider och proteiner. Specifikt, genom att undersöka lipiddroppa.......

DO-SRS och 2PEF-avbildning har tillämpats för att undersöka metabolisk dynamik i olika ex vivo-modeller, inklusive Drosophila och humana vävnader 21,22,23,24,26,27,33. Bildmodaliteten som används i denna studie integrerar DO-SRS- och 2PEF-mikroskopi, vilket kan överträffa and.......

Vi tackar Dr. Yajuan Li och Anthony Fung för deras tekniska support och Fraley-labbet för cellinjen. Vi erkänner startfonderna från UCSD, NIH U54CA132378, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIHU54DK134301, NIHU54 HL165443 och Hellman Fellow Award.