Dissecção e Isolamento de Tecido Pulmonar Descelularizado Regional-Específico

Resumo

Apresenta-se um protocolo para o isolamento de tecido pulmonar decelularizado regional. Este protocolo fornece uma ferramenta poderosa para o estudo de complexidades na matriz extracelular e interações célula-matriz.

Resumo

O transplante pulmonar é muitas vezes a única opção para pacientes em estágios mais avançados de doença pulmonar grave, mas isso é limitado tanto devido ao suprimento de pulmões de doadores adequados quanto à rejeição aguda e crônica após o transplante. Determinar novas abordagens de bioengenharia para a substituição de pulmões doentes é imperativo para melhorar a sobrevida dos pacientes e evitar complicações associadas às metodologias atuais de transplante. Uma abordagem alternativa envolve o uso de pulmões inteiros descelularizados sem constituintes celulares que são tipicamente a causa da rejeição aguda e crônica. Como o pulmão é um órgão tão complexo, é de interesse examinar os componentes da matriz extracelular de regiões específicas, incluindo a vasculatura, as vias aéreas e o tecido alveolar. O objetivo dessa abordagem é estabelecer métodos simples e reprodutíveis pelos quais os pesquisadores possam dissecar e isolar tecidos específicos da região de pulmões totalmente decelularizados. O protocolo atual foi desenvolvido para pulmões de suínos e humanos, mas pode ser aplicado a outras espécies também. Para esse protocolo, foram especificadas quatro regiões do tecido: via aérea, vasculatura, alvéolos e tecido pulmonar volumoso. Este procedimento permite a obtenção de amostras de tecido que representam com mais precisão o conteúdo do tecido pulmonar decelularizado, em oposição aos métodos tradicionais de análise em massa.

Introdução

Atualmente, as doenças pulmonares, incluindo a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), a fibrose pulmonar idiopática (FPI) e a fibrose cística (FC), permanecem sem cura 1,2,3,4. O transplante pulmonar é muitas vezes a única opção para pacientes em estágios mais avançados, porém continua sendo uma opção limitada, tanto pelo suprimento de pulmões de doadores adequados quanto pela rejeição aguda e crônica após o transplante ^3,5,6. Como tal, há uma necessidade crítica de novas estratégias de tratamento. Uma abordagem promissora em bioengenharia respiratória é a aplicação de arcabouços derivados de tecidos preparados a partir de tecido pulmonar nativo decelularizado. Como os arcabouços pulmonares acelulares retêm grande parte da complexidade da composição e bioatividade da matriz extracelular nativa (MEC), eles têm sido intensamente estudados para engenharia de órgãos inteiros e como modelos aprimorados para o estudo de mecanismos de doenças pulmonares 7,8,9,10. Paralelamente, há um crescente interesse na utilização de tecidos decelularizados de diferentes órgãos, incluindo pulmões, como hidrogéis e outros substratos para o estudo das interações célula-célula e célula-MEC em modelos de cultura de organoides e outros tecidos 11,12,13,14,15,16,17 . Estes fornecem modelos mais relevantes do que substratos comercialmente disponíveis, como o Matrigel, derivado de fontes tumorais. No entanto, as informações sobre hidrogéis derivados do pulmão humano são relativamente limitadas no momento. Descrevemos previamente hidrogéis derivados de pulmões de porcos decelularizados e caracterizamos suas propriedades mecânicas e materiais, bem como demonstramos sua utilidade como modelos de cultura celular^18,19. Um relato recente detalhou a caracterização mecânica e viscoelástica inicial de hidrogéis derivados de pulmões humanos normais e doentes (DPOC, FPI)^{decelularizados 20}. Também apresentamos dados iniciais caracterizando o conteúdo de glicosaminoglicanos de pulmões humanos normais e DPOC decelularizados, bem como sua aplicabilidade no estudo das interações célula-célula e^{célula-MEC11}.

Esses exemplos ilustram o poder da utilização de ECMs de pulmão humano decelularizado para fins investigativos. No entanto, o pulmão é um órgão complexo, e tanto a estrutura quanto a função variam em diferentes regiões do pulmão, incluindo a composição da MEC e outras propriedades, como a rigidez^21,22. Dessa forma, é de interesse estudar a MEC em regiões individuais do pulmão, incluindo traqueia e grandes vias aéreas, médias e pequenas vias aéreas e alvéolos, bem como grandes, médios e pequenos vasos sanguíneos. Para isso, desenvolvemos um método confiável e reprodutível para dissecar pulmões humanos e suínos descelularizados e, posteriormente, isolar cada uma dessas regiões anatômicas. Isso permitiu uma análise diferencial detalhada do conteúdo proteico regional em pulmões normais e doentes²¹.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram realizados de acordo com a IACUC da Universidade de Vermont (UVM). Todos os pulmões humanos foram adquiridos dos Serviços de Autópsia da UVM e os estudos relacionados foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB da UVM.

NOTA: A decelularização de pulmões de suínos e humanos já foi descrita pelo nosso grupo 7,8,9,10,21. Em resumo, lobos pulmonares inteiros são decelularizados através da perfusão sequencial das vias aéreas e da vasculatura com uma série de soluções enzimáticas e detergente de 2 L usando uma bomba peristáltica: Triton-X 100 a 0,1%, desoxicolato de sódio a 2%, cloreto de sódio 1 M, DNase 30 μg/mL/1,3 mM MgSO_{CaCl 2} 4/2 mM, ácido peracético a 0,1%/etanol a 4%, e uma lavagem com água deionizada. Os métodos padrão para confirmar a descelularização eficiente incluem a determinação de DNA residual de fita dupla de <50 ng/mg dentro de pulmões decelularizados e a ausência de fragmentos de DNA por eletroforese em gel, e a coloração nuclear pela coloração de hematoxilina e eosina (H&E) ^9,21.

1. Configuração

1. Reúna todos os equipamentos necessários para o procedimento de dissecção, incluindo uma caçarola de vidro, dois pares de pinças cirúrgicas, um par de pinças e uma tesoura cirúrgica e autoclave antes do uso.
2. Obter uma seção do pulmão, colocá-lo na caçarola de vidro e orientá-lo para que a extremidade superior da via aérea possa ser vista claramente.
3. Identificar a extremidade proximal da vasculatura e mantê-la intacta até os passos posteriores. A extremidade da vasculatura deve ser claramente visível e de cor branca totalmente opaca.
4. Usando uma pinça e tesoura cirúrgica, remova qualquer pleura que possa estar forrando o exterior do pulmão e descarte.

2. Exposição da via aérea

1. Usando uma técnica de espalhamento com a tesoura cirúrgica, trabalhe suavemente para expor a via aérea adicional.
   1. Localize a maior via aérea, que normalmente terá um diâmetro de aproximadamente 2-4 cm. Outra forma de identificar uma via aérea é através da observação de anéis cartilaginosos, que podem ser detectados visualmente ou através da palpação do tecido.
   2. Usando um par de pinças, palpar o comprimento da via aérea para determinar a localização da via aérea invisível a uma profundidade de aproximadamente 1 pol.
      NOTA: Por ser revestida por anéis de cartilagem, a via aérea é caracteristicamente mais dura que os demais tecidos pulmonares. Como tal, encontrar e palpar a via aérea invisível deve ser relativamente simples.
   3. Segurando a tesoura cirúrgica paralela à via aérea, insira as pontas fechadas no tecido que envolve diretamente a via aérea invisível.
   4. Abra lentamente a tesoura cirúrgica para afastar suavemente a membrana circundante. Em seguida, retire a tesoura cirúrgica e evite cortar qualquer tecido.
   5. Repita esse processo intermitentemente durante todo o procedimento de dissecção para continuar expondo a via aérea.
2. Com a tesoura cirúrgica, cortar a via aérea nos pontos de ramificação e dissecar ao longo de cada ramo de forma independente.
   NOTA: Um ponto de ramificação é um local no qual uma via aérea se divide em duas vias aéreas separadas.
3. Regiões severas da via aérea, uma vez confiantes de que as extremidades intactas permanecerão identificáveis e facilmente localizadas para posterior dissecção.
4. Coloque regiões cortadas da via aérea no tubo correspondente. O tamanho das regiões cortadas varia dependendo da amostra, mas, em geral, varia entre 1 e 5 cm de comprimento. A largura varia de acordo com a localização relativa ao longo da árvore das vias aéreas, com as regiões distais mantendo larguras menores do que as regiões mais proximais.

3. Expondo e excisando regiões da vasculatura

1. Aplique uma pressão suave na vasculatura e afaste-se lentamente das vias aéreas. Deixe a vasculatura esticar ligeiramente e use uma tesoura cirúrgica para separar ainda mais a vasculatura da via aérea.
   NOTA: Muita pressão irá rasgar a vasculatura. Se a vasculatura rasgar, basta colocar essa seção da vasculatura no tubo marcado correspondente e identificar sua extremidade intacta.
2. Quando um ponto de ramificação na árvore vascular tiver sido exposto, use tesoura cirúrgica e pinça para expor regiões mais inferiores da vasculatura.
   1. Comece inserindo as pontas fechadas da tesoura cirúrgica logo abaixo de um ponto de ramificação e entre as duas regiões vasculares correspondentes.
   2. Abra lentamente a tesoura para espalhar os tecidos subjacentes.
   3. De forma intermitente, use uma pinça para remover o tecido que foi espalhado com a tesoura cirúrgica, bem como qualquer outro tecido que envolva diretamente a vasculatura.
3. Quando a vasculatura estiver cobrindo regiões da via aérea ou se tornando incômoda para qualquer etapa do procedimento de dissecção, corte a vasculatura em um ponto de ramificação e disseque ao longo de cada ramo independentemente.
4. Regiões severas da vasculatura uma vez confiantes de que as extremidades intactas permanecerão identificáveis e facilmente localizadas para posterior dissecção.

4. Identificação e excisão do tecido alveolar

1. Usando um par de pinças ou pinças, aperte e depois rasgue suavemente pequenas regiões de tecido alveolar.
   1. Localizar uma região de tecido que não esteja nas proximidades diretas da via aérea ou da vasculatura.
   2. Usando a pinça, pinça uma pequena região do tecido que parece ser desprovida de qualquer vasculatura ou via aérea.
   3. Rasgue a região pinçada do tecido do pulmão.
2. Observe a região do tecido removido e confirme se é ou não tecido alveolar.
   OBS: O tecido alveolar está presente em todo o pulmão, por isso pode e deve ser removido durante todo o procedimento de dissecção. Qualquer tecido que não possa ser facilmente identificado como primariamente alvéolos, vasculatura ou via aérea deve ser categorizado como tecido volumoso e colocado no tubo marcado correspondente.

Resultados

Um esquema geral do protocolo é mostrado na Figura 1. Uma vez dominada, a dissecção regional do tecido pulmonar decelularizado é facilmente reprodutível. A determinação da categorização de cada amostra de tecido cortado é imprescindível para o sucesso do procedimento de dissecção. O tecido vascular é substancialmente mais elástico do que as vias aéreas, portanto, o uso de pinças para esticar o tecido é frequentemente um forte indicador de se uma determinada amostra é vascu...

Discussão

Tecidos decelularizados de humanos e de outras espécies são frequentemente utilizados como biomateriais para estudar a composição da MEC, bem como interações célula-MEC em modelos de cultura ex vivo, incluindo hidrogéis 3D^12,13. À semelhança de outros órgãos, pulmões descelularizados têm sido previamente utilizados para determinar diferenças na composição da MEC em pulmões saudáveis versus doentes (isto é, enfisematosos e FPI) e estã...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bonn Scissors	Fine Science Tools	14184-09
Dumont #5 - Fine Forceps	Fine Science Tools	11254-02
Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm	CellPath	N/A
Hardened Fine Scissors	Fine Science Tools	14090-11
Moria Iris Forceps	Fine Science Tools	11373-22
Pyrex Glass Casserole Dish	Cole-Parmer	3175-10