Engenharia Genética Mediada por Agrobacterium tumefaciens de Microalgas Verdes, Chlorella vulgaris

Summary

Este protocolo descreve a utilização da transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) para integrar gene(s) de interesse no genoma nuclear da microalga verde Chlorella vulgaris, levando à produção de transformantes estáveis.

Abstract

A transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (AMT) serve como uma ferramenta amplamente empregada para manipular genomas de plantas. No entanto, A. tumefaciens exibe a capacidade de transferência gênica para diversas espécies. Numerosas espécies de microalgas carecem de métodos bem estabelecidos para integrar de forma confiável genes de interesse em seu genoma nuclear. Para aproveitar os benefícios potenciais da biotecnologia de microalgas, ferramentas simples e eficientes de manipulação do genoma são cruciais. Neste trabalho, um protocolo AMT otimizado é apresentado para a espécie de microalgas industriais Chlorella vulgaris, utilizando a proteína fluorescente verde repórter (mGFP5) e o marcador de resistência a antibióticos para Hygromycin B. Os mutantes são selecionados através de plaqueamento em meio Tris-Acetato-Fosfato (TAP) contendo Higromicina B e cefotaxima. A expressão de mGFP5 é quantificada via fluorescência após mais de dez gerações de subcultivo, indicando a transformação estável do de T-DNA. Este protocolo permite a geração confiável de múltiplas colônias transgênicas de C. vulgaris em menos de duas semanas, empregando o vetor de expressão vegetal pCAMBIA1302 comercialmente disponível.

Introduction

Agrobacterium tumefaciens, uma bactéria gram-negativa transmitida pelo solo, possui uma capacidade única de transferência de genes entre reinos, o que lhe rendeu o título de "engenheiro genético natural"¹. Essa bactéria pode transferir DNA (T-DNA) de um plasmídeo indutor de tumor (Ti-Plasmid) para as células hospedeiras através de um sistema de secreção Tipo IV, resultando na integração e expressão do DNA-T no genoma do hospedeiro1,2,3,4. No ambiente natural, esse processo leva à formação de tumores em planta....

Protocol

Todos os suportes e soluções devem ser autoclavados antes da utilização, salvo indicação em contrário. Todos os tubos de centrífuga, pontas de pipeta, etc., devem ser estéreis ou autoclavados antes do uso. Para facilitar a consulta, as receitas de mídia utilizadas neste protocolo estão listadas na Tabela 1.

1. Preparação de células eletrocompetentes de A. tumefaciens

1. Inocular Agrobacterium (AGL-1) em um frasco de 25 m.......

Discussion

A eficiência da transformação está associada a vários parâmetros diferentes. A escolha das cepas de A. tumefaciens utilizadas para TMA é crucial. A AGL-1 é uma das cepas mais invasivas descobertas e, por esse motivo, tem sido rotineiramente utilizada em plantas AMT. A suplementação do meio de indução com glicose (15-20 mM) também é importante para a eficiência da AMT. Considerando que C. vulgaris pode crescer em condições fototróficas e heterotróficas, glicose ou outras fontes de carb.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 Kb Plus DNA ladder	FroggaBio	DM015
Acetosyringone	Fisher Scientific	D26665G
Agrobacterium tumefaciens	Gold Biotechnologies	Strain: AGL-1; Gift from Prof. Paul Hooykaas	Genotype: C58 RecA (RifR/CarbR) pTiBo542DT-DNA
Biotin	Enzo Life Sciences	89151-400
CaCl2·2H2O	VWR	BDH9224-1KG
Cefotaxime	AK Scientific	J90010
Chlorella vulgaris	University of Texas at Austin Culture Collection of Algae	Strain: UTEX 395	Wildtype strain
CoCl2·6H2O	Sigma Aldrich	C8661-25G
CuSO4·5H2O	EMD Millipore	CX2185-1
FeCl3·6H2O	VWR	BDH9234-500G
Gene Pulser Xcell Electroporator	Bio-Rad	1652662	Main unit equipped with PC module.
GeneJET Plant Genome Purification Kit	Thermo Scientific	K0791
Glacial acetic acid	VWR	CABDH3093-2.2P
Glycerol	BioBasic	GB0232
HEPES Buffer	Sigma Aldrich	H-3375
Hygromycin B	Fisher Scientific	AAJ6068103
K2HPO4	VWR	BDH9266-500G
Kanamycin	Gold Biotechnologies	K-250-25
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
MgSO4·7H2O	VWR	97062-134
MnCl2·4H2O	JT Baker	BAKR2540-01
Na2CO3	VWR	BDH7971-1
Na2EDTA·2H2O	JT Baker	8993-01
Na2MoO4·2H2O	JT Baker	BAKR3764-01
NaCl	VWR	BDH7257-7
NaH2PO4 H2O	Millipore Sigma	CA80058-650
NaNO3	VWR	BDH4574-500G
NEBExpress Ni Resin	NewEngland BioLabs	NEB #S1427
NH4Cl	VWR	BDH9208-500G
pCAMBIA1302	Leiden University	Gift from Prof. Paul Hooykaas	pBR322, KanR, pVS1, T-DNA(CaMV 35S/HygR/CaMV polyA, CaMV 35S promoter/mgpf5-6xhis/NOS terminator)
Polypropylene Columns (5 mL)	QIAGEN	34964
Precision Plus Protein Unstained Protein Standards, Strep-tagged recombinant, 1 mL	Bio-Rad	1610363
Rifampicin	Millipore Sigma	R3501-1G
SunBlaster LED Strip Light 48 Inch	SunBlaster	210000000906
Synergy 4 Microplate UV/Vis spectrometer	BioTEK	S4MLFPTA
Tetracycline	Thermo Scientific Chemicals	CAAAJ61714-14
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 12%	Bio-Rad	1610185
Thiamine	TCI America	T0181-100G
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500
Tryptone	BioBasic	TG217(G211)
Vitamin B12 (cyanocobalamin)	Enzo Life Sciences	89151-436
Yeast Extract	BioBasic	G0961
ZnSO4·7H2O	JT Baker	4382-01