일차 해마 뉴런의 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질의 효과를 측정하기 위해 Live-Cell Imaging 사용

Summary

여기에서는 1차 해마 설치류 뉴런의 transfection과 live-cell confocal imaging을 결합하여 축삭 수송에 대한 병리학적 단백질 유도 효과를 분석하고 이러한 효과를 매개하는 기계론적 경로를 식별하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

축삭을 따라 화물을 양방향으로 운반하는 것은 기능적 시냅스, 신경 연결성 및 건강한 뉴런을 유지하는 데 중요합니다. 축삭 수송은 여러 신경 퇴행성 질환에서 방해를 받으며, 투영 뉴런은 세포 물질을 장거리로 운반하고 상당한 축삭 질량을 유지해야 하기 때문에 특히 취약합니다. 타우(tau), 아밀로이드-β, α-시누클레인(-synuclein), 슈퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase) 및 헌팅틴(huntingtin)을 포함한 여러 질병 관련 단백질의 병리학적 변형은 수송에 부정적인 영향을 미치며, 병리학적 단백질이 질병에 독성을 발휘하는 잠재적인 공통 메커니즘을 제공합니다. 이러한 독성 메커니즘을 연구하는 방법은 신경 퇴행성 질환을 이해하고 잠재적인 치료 개입을 식별하는 데 필요합니다.

여기에서 배양된 1차 설치류 해마 뉴런을 여러 플라스미드와 함께 transfection하여 형광 태그가 부착된 화물 단백질의 생세포 공초점 이미징을 사용하여 병리학적 단백질이 빠른 축삭 수송에 미치는 영향을 연구합니다. 우리는 설치류에서 주요 해마 뉴런의 수확, 해리 및 배양으로 시작합니다. 그런 다음 뉴런을 플라스미드 DNA 구조와 함께 transfection하여 형광 태그가 지정된 화물 단백질과 야생형 또는 돌연변이 타우(병리학적 단백질의 예시로 사용됨)를 발현합니다. 축삭돌기는 축삭돌기 초기 분절 단백질인 neurofascin의 세포외 도메인과 결합하는 항체를 사용하여 살아있는 세포에서 식별되며, 축삭 관심 영역을 이미지화하여 형광 화물 수송을 측정합니다.

무료로 사용할 수 있는 ImageJ 매크로인 KymoAnalyzer를 사용하여 병리학적 단백질의 존재에 의해 영향을 받을 수 있는 축삭 이동의 속도, 일시 중지 빈도 및 방향성 화물 밀도를 광범위하게 특성화합니다. 이 방법을 통해 병리학적 타우 단백질의 발현과 관련된 화물 일시 중지 빈도 증가의 표현형을 식별합니다. 또한 유전자 침묵 shRNA 구조를 transfection mix에 추가하여 수송 중단을 매개하는 다른 단백질의 역할을 테스트할 수 있습니다. 이 프로토콜은 다른 신경퇴행성 질환 관련 단백질과 함께 사용하기 위해 쉽게 적용할 수 있으며 이러한 단백질이 축삭 수송을 방해하는 메커니즘을 연구하는 재현 가능한 방법입니다.

Introduction

뉴런은 기능적 시냅스와 신경 연결성을 유지하기 위해 축삭을 따라 화물을 양방향으로 운반하는 데 의존합니다. 축삭 수송 결핍은 알츠하이머병(AD) 및 기타 타우병증, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증 및 헌팅턴병을 포함한 여러 신경퇴행성 질환의 발병에 중요한 기여를 하는 것으로 생각됩니다 ^1,2,3. 실제로, 여러 질병 관련 단백질에 대한 병리학적 변형은 수송에 부정적인 영향을 미친다(⁴에서 검토). 병리학적 단백질이 질병에 독성을 발휘하는 메커니즘을 조사하는 방법을 개발하는 것은 신경퇴행성 질환을 이해하고 치료적 개입을 위한 잠재적 표적을 식별하는 데 필요합니다.

기존의 키네신(kinesin), 운동 단백질을 조절하는 키나아제(kinase) 및 인산가수분해효소(phosphatase) 의존 경로, 병리학적 단백질이 축삭 이동의 조절을 방해하는 메커니즘의 발견을 포함하여 축삭 수송에 대한 몇 가지 중요한 통찰력은 분리된 오징어 축삭질 모델....

Protocol

이 프로토콜은 Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 C57BL/6J 배경의 Tau Knockout 마우스와 야생형 Sprague Dawley 마우스에 성공적으로 적용되었습니다. 다른 균주도 허용되어야 합니다.

1. 1차 해마 뉴런 수확

1. 붕산염 완충액(12.5mM 붕산나트륨 데카하이드레이트 및 50mM 붕산)에 여과된 0.5m.......

Discussion

다양한 신경 퇴행성 질환과 관련된 여러 병리학적 단백질이 뉴런의 빠른 축삭 수송을 방해한다는 증거가 증가하고 있습니다. 이는 이러한 질병 전반에 걸쳐 신경독성의 잠재적인 공통 메커니즘을 나타냅니다. 이러한 단백질이 수송을 방해하는 과정을 더 잘 이해하려면 특정 질문을 해결할 수 있는 도구와 모델이 필요합니다. 여기에 설명된 방법을 사용하면 설치류의 일?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan blue	Gibco	15250-061
1.7 mL microcentrifuge tubes	DOT	RN1700-GMT
2.5% trypsin	Gibco	15090-046
3 mL syringe with 21 G needle	Fisher	14-826-84
10 mL plastic syringe	Fisher	14-823-2A
14 G needle	Fisher	14-817-203
15 G needle	Medline	SWD200029Z
16 G needle	Fisher	14-817-104
18 G needle	Fisher	14-840-97
22 G needle	Fisher	14-840-90
32% paraformaldehyde	Fisher	50-980-495
AlexaFluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen	A21244	RRID:AB_2535813
Amphotericin B	Gibco	15290-026
Arruga Micro Embryonic Capsule Forceps, Curved; 4"	Roboz	RS-5163	autoclave
B-27 Supplement (50x), serum free	Gibco	A3582801
BioCoat 24-well Poly D lysine plates	Fisher	08-774-124
boric acid	Sigma	B6768-1KG
Calcium chloride	Sigma	C7902
Castroviejo 3 1/2" Long 8 x 0.15 mm Angle Sharp Scissors	Roboz	RS-5658	autoclave
Cell counting device			automatic or manual
Confocal microscope with live cell chamber attachment
Confocal imaging software
D-(+)-glucose	Sigma	G7528
DNase I (Worthington)	Fisher	NC9185812
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14200-075
EGTA	Fisher	O2783-100
Fatal-Plus Solution	Vortech Pharmaceuticals, LTD	NDC 0298-9373-68	sodium pentobarbital; other approved methods of euthanasia may be used
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000044
Gentamicin Reagent Solution	Gibco	15710-072
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hanks' Balanced Salt Solution	Gibco	24020-117
ImageJ version 1.51n	ImageJ		Life-Line version 2017 May 30: https://imagej.net/software/fiji/downloads
KymoAnalyzer (version 1.01)	Encalada Lab		Package includes all 6 macros: https://www.encalada.scripps.edu/kymoanalyzer
Lipofectamine 3000	Invitrogen	100022050	Use with P3000 transfection enhancer reagent
Magnesium chloride	Fisher	AC223211000
MES hydrate	Sigma	M8250
Micro Dissecting Scissors 3.5" Straight Sharp/Sharp	Roboz	RS-5910	autoclave
Neurobasal Plus medium	Gibco	A3582901
Neurofascin (A12/18) Mouse IgG2a	UC Davis/NIH NeuroMab	75-172	RRID:AB_2282826; 250 ng/mL; Works in rat neurons, NOT in mouse neurons
Neurofascin 186 (D6G60) Rabbit IgG	Cell Signaling	15034	RRID:AB_2773024; 500 ng/mL; Works in mouse neurons, we have not tested in rat neurons
newborn calf serum	Gibco	16010-167
Opti-MEM	Gibco	31985-062
P3000	Invitrogen	100022057
Petri dish, 100 x 10 mm glass	Fisher	08-748B	For dissection; autoclave
Petri dish, 100 x 20 mm glass	Fisher	08-748D	To place uterine horns in; autoclave
Poly-D-lysine	Sigma	P7886-100MG
Polypropylene conical centrifuge tubes (15 mL)	Fisher	14-955-238
Polypropylene conical centrifuge tubes (50 mL)	Fisher	14-955-238
Potassium chloride	Fisher	P217-500
Sodium acetate	Sigma	S5636
sodium borate decahydrate	VWR	MK745706
Straight-Blade Operating Scissors Blunt/Sharp	Fisher	13-810-2	autoclave
Syringe Filters, 0.22 µm	VWR	514-1263
Thumb dressing forceps, serrated, 4.5"	Roboz	RS-8100	autoclave
µ-Slide 4 Well Glass Bottom	Ibidi	80427