Modelagem de microambientes vaginais saudáveis e disbióticos em uma vagina humana em um chip

Summary

Este artigo descreve um protocolo para a criação de um dispositivo de cultura microfluídica vagina-on-a-chip (Vagina Chip) que permite o estudo das interações do hospedeiro humano com um microbioma vaginal vivo sob condições microaerofílicas. Este chip pode ser usado como uma ferramenta para investigar doenças vaginais, bem como para desenvolver e testar possíveis contramedidas terapêuticas.

Abstract

A saúde das mulheres, e particularmente as doenças do trato reprodutivo feminino (TRF), não receberam a atenção que merecem, embora um sistema reprodutivo insalubre possa levar a doenças com risco de vida, infertilidade ou resultados adversos durante a gravidez. Uma barreira no campo é que tem havido uma escassez de modelos experimentais pré-clínicos que imitam fielmente a fisiologia e a fisiopatologia do FRT. Os modelos in vitro e animais atuais não recapitulam totalmente as alterações hormonais, as condições microaeróbicas e as interações com o microbioma vaginal. O advento da tecnologia de cultura microfluídica Organ-on-a-Chip (Organ Chip) que pode imitar interfaces tecido-tecido, perfusão vascular, fluxos de fluido intersticial e o microambiente físico de uma subunidade importante de órgãos humanos pode potencialmente servir como uma solução para esse problema. Recentemente, foi desenvolvido um chip de vagina humana que suporta a co-cultura de consórcios microbianos vaginais humanos com epitélio vaginal humano primário que também tem interface com o estroma vaginal e experimenta fluxo dinâmico de fluido. Este chip replica as respostas fisiológicas da vagina humana a microbiomas saudáveis e disbióticos. Um protocolo detalhado para a criação de chips de vagina humana foi descrito neste artigo.

Introduction

Um microbioma vaginal dominado por Lactobacillus spp. que ajuda a manter um microambiente ácido desempenha um papel importante na manutenção da saúde reprodutiva feminina¹. No entanto, às vezes pode haver uma mudança na composição das comunidades microbianas que compõem o microbioma, o que resulta em um aumento na diversidade de bactérias vaginais. Essas alterações disbióticas, que muitas vezes resultam em uma mudança de um estado dominado por Lactobacillus para um dominado por espécies bacterianas anaeróbias mais diversas (por exemplo, Gardnerella vaginalis), estão associadas a várias doenças do sistema reprodutivo, ....

Protocol

Esta pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais para o uso de células humanas. As células foram obtidas comercialmente (ver Tabela de Materiais). Todas as etapas devem ser realizadas assepticamente em um gabinete de biossegurança (BSC). Use apenas ponteiras de pipeta de filtro (ou barreira) para este protocolo.

1. Cultura de células epiteliais vaginais humanas

1. Aqueça 50 mL de meio epitelial vaginal (VEM, consulte

Discussion

Modelos in vitro anteriores da vagina humana não replicam fielmente as estruturas do tecido vaginal, o fluxo de fluido e as interações hospedeiro-patógeno^19,22. Os modelos animais também são limitados pela variação interespécies no microbioma e diferenças no ciclo estral ou menstrual^19,22. Este manuscrito descreve um protocolo para criar um modelo de Chip de Órgão da vagina humana que.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip	Millipore	SCGP00525	To degas media
2 channel chip	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
200 μL barrier tips (or filter tips)	Thomas Scientific, SHARP	1159M40	Tips used for chip seeding
Activation Reagent 1 (or ER-1 powder)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature -20 °C
Activation Reagent 2 (or ER-2 solution)	Emulate	Chip S1 Basic Research kit-24PK	Part of the two-channel Chip kit; Storage temperature 4 °C
Adenine	Sigma Aldrich	A2786	Component of the Differentiation media
Brucella blood agar plates	VWR International Inc.	89405-032	with Hemin and Vitamin K; For the enumeration of Gardnerella vaginalis
Ca2+ and Mg2+ free DPBS (DPBS (-/-)	ScienCell	303	For washing cells
Calcium Chloride	Sigma Aldrich	C5670	Component of the Differentiation media
Calcium chloride (anhyd.)	Sigma Aldrich	499609	Component of HBSS (LB/+G)
Collagen I	Corning	354236	For the coating solution for HVEC
Collagen IV	Sigma Aldrich	C7521	For the coating solution for HVEC
Collagenase IV	Gibco	17104019	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Complete fibroblast medium	ScienCell	2301	Media for the culture of HUF
Complete vaginal epithelium medium	Lifeline	LL-0068	Media for the culture of HVEC
D-Glucose (dextrose)	Sigma Aldrich	158968	Component of HBSS (LB/+G)
DMEM (Low Glucose)	Thermofisher	12320-032	Component of the Differentiation media
Dynamic Flow Module (or Zoë)	Emulate	Zoë-CM1	Regulates the flow rate of the chips
Ham's F12	Thermofisher	11765-054	Component of the Differentiation media
Heat inactivated FBS	Thermofisher	10438018	Component of the Differentiation media
Human uterine fibroblasts	ScienCell	7040	HUF
Human vaginal epithelial cells	Lifeline	FC-0083	HVEC
Hydrocortisone	Sigma Aldrich	H0396	Component of the Differentiation media
ITES	Lonza	17-839Z	Component of the Differentiation media
L-glutamine	Thermofisher	25030081	Component of the Differentiation media
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma Aldrich	M2393	Component of HBSS (LB/+G)
Magnesium sulfate heptahydrate	Sigma Aldrich	M1880	Component of HBSS (LB/+G)
MRS agar plates	VWR International Inc.	89407-214	For enumeration of Lactobacillus
O-phosphorylethanolamine	Sigma Aldrich	P0503	Component of the Differentiation media
Pen/Strep	Thermofisher	15070063	Component of the Differentiation media
pH strips	Fischer-Scientific	13-640-520	For measurement of pH
Pods (1/chip)	Emulate	BRK-S1-WER-24	Part of the two-channel Chip kit
Poly-L-lysine	ScienCell	403	For the coating solution for HUFs
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911	Component of HBSS (LB/+G)
Potassium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	P0662	Component of HBSS (LB/+G)
Sterile 80% glycerol	MP Biomedicals	113055034	For freezing bacterial samples
Triiodothyronine	Sigma Aldrich	T6397	Component of the Differentiation media
Trypan Blue Solution (0.4%)	Sigma Aldrich	T8154	For counting live/dead cells
TrypLE Express	Thermofisher	12605010	For the dissociation of cells from the Vagina Chips
Trypsin Neutralizing Solution (TNS)	ScienCell	113	For neutralization of Trypsin
Trypsin/EDTA Solutiom (0.25%)	ScienCell	103	For cell dissociation
β-estradiol	Sigma Aldrich	E2257	Hormone for differentiation media